Un metodo statico auto-diretto per generare organiidi cerebrali da cellule staminali embrionali umane
Summary
Questo protocollo è stato generato come mezzo per produrre organoidi cerebrali in modo semplificato e a basso costo senza fattori di crescita esogeni o matrice di membrana seminterrato, pur mantenendo la diversità dei tipi di cellule cerebrali e molte caratteristiche dell’organizzazione cellulare.
Abstract
Gli organoidi cerebrali umani differenziati dalle cellule staminali embrionali offrono l’opportunità unica di studiare interazioni complicate di più tipi di cellule in un sistema tridimensionale. Qui vi presentiamo un metodo relativamente semplice e poco costoso che produce organoidi cerebrali. In questo protocollo le cellule staminali pluripotenti umane sono suddivise in piccoli ammassi invece di singole cellule e coltivate in supporti di base senza una matrice di membrana del seminterrato etesologa o fattori di crescita esogeni, consentendo ai segnali di sviluppo intrinseci di modellare il crescita dell’organoide. Questo semplice sistema produce una varietà di tipi di cellule cerebrali tra cui cellule gliali e microgliali, cellule staminali e neuroni del prosencefalo, del cervello medio e del cervello posteriore. Gli organoidi generati da questo protocollo mostrano anche segni distintivi di un’appropriata organizzazione temporale e spaziale dimostrati da immagini luminose, istologia, immunofluorescenza e reazione della catena di trascrizione inversa quantitativa in tempo reale ( qRT-PCR). Poiché questi organoidi contengono tipi di cellule da varie parti del cervello, possono essere utilizzati per studiare una moltitudine di malattie. Per esempio, in un recente articolo abbiamo dimostrato l’uso di organoidi generati da questo protocollo per studiare gli effetti dell’ipossia sul cervello umano. Questo approccio può essere utilizzato per studiare una serie di condizioni altrimenti difficili da studiare come gli handicap del neurosviluppo, i disturbi genetici e le malattie neurologiche.
Introduction
A causa di una miriade di limitazioni pratiche ed etiche, c’è stata una grande difficoltà nello studio del cervello umano. Mentre gli studi che utilizzano roditori sono stati fondamentali per la nostra comprensione del cervello umano, il cervello del topo ha molte differenze1,2. È interessante notare che i topi hanno una densità neuronale che è almeno 7 volte inferiore al cervello dei primati3,4. Anche se i primati sono più vicini agli esseri umani rispetto ai roditori da un punto di vista evolutivo, non è pratico per la maggior parte dei ricercatori lavorare con loro. Lo scopo di questo protocollo era quello di riassumere molte caratteristiche importanti del cervello umano utilizzando un metodo semplificato e meno costoso senza la necessità di una matrice di membrana seminterrato eterologa o fattori di crescita esogeni pur mantenendo la diversità delle cellule cerebrali e l’organizzazione cellulare.
Il lavoro formativo del laboratorio Sasai ha utilizzato la coltura senza siero dei corpi embrionali (SFEBq) per generare tipi di cellule neuronali bidimensionali e tridimensionali da cellule staminali embrionali (ESC) segnalate5,6. Molti metodi organoidi del cervello umano hanno seguito un percorso relativamente simile rispetto alle ESC segnalate7,8. Al contrario, questo protocollo inizia con cluster di ESC umani distaccati (hESC), simili ai primi passi del lavoro seminale dei laboratori Thomson e zhang prima delle fasi di placcatura9,10, così come la fase iniziale del protocollo organoide cerebrale del laboratorio Pasca prima dell’aggiunta di fattori di crescita esogeni11. Le matrici a membrana del seminterrato (ad esempio, matrigel) sono state utilizzate in molti protocolli organoidi cerebrali ed è stato dimostrato di essere un efficace scaffold8. Tuttavia, le matrici di membrana seminterrato più comunemente utilizzate non vengono senza complicazioni in quanto co-purificano con quantità sconosciute di fattori di crescita con variabilità batch a batch durante la produzione12. Inoltre, queste matrici possono complicare l’imaging e aumentare il rischio di contaminazione e costi.
Mentre gli organoidi del cervello umano possono essere utilizzati per rispondere a molte domande, ci sono alcune limitazioni da tenere a mente. Per uno, a partire dalle cellule staminali embrionali, gli organoidi assomigliano più da vicino acerrimi cerebrali immaturi rispetto ai cervelli invecchiati e come tali potrebbero non essere modelli ideali per malattie che si verificano nella vecchiaia, come il morbo di Alzheimer. In secondo luogo, mentre il nostro protocollo ha trovato marcatori di prosencefalo, sviluppo del cervello e del cervello posteriore che sono utili per studiare l’effetto di un trattamento o di una malattia sulle cellule di più regioni cerebrali in concerto, altri protocolli possono essere seguiti per concentrarsi su specifiche regioni del cervello13,14. Infine, un’altra limitazione dei modelli organoidi è quella delle dimensioni, mentre la lunghezza media di un cervello umano di circa 167 mm, gli organoidi cerebrali fatti con l’uso di agitazione crescono fino a 4 mm8 e gli organoidi formati da questo protocollo crescono a 1-2 mm di 10 settimane. Ciò nonostante, Questo protocollo fornisce uno strumento importante per studiare il tessuto cerebrale umano e l’interazione di più tipi di cellule.
Protocol
Representative Results
Discussion
Simile ad altri modelli organoidi, questo è un sistema artificiale che viene fornito con diversi avvertimenti. Anche se c’era poco batch di variazione batch in termini di livelli di espressione complessiva, organidi singoli ha mostrato differenze. Ad esempio, la posizione delle aree positive Sox-2 non era identica in ogni organoide (Figura 3). Mentre qPCR è adatto a cercare cambiamenti complessivi in lotti di cellule, tecniche aggiuntive come gli RNA a cella singola saranno utilizzati in studi futuri p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo lo Yale Stem Cell Core (YSCC) e lo Yale Cancer Center (YCC) per l’assistenza. Ringraziamo il dottor Jung Kim per la sua recensione neurologica. Questo lavoro è stato sostenuto dal Connecticut Regenerative Medicine Research Fund, March of Dimes, e NHLBI R01HL131793 (S.G.K.), lo Yale Cancer Center e il Yale Cancer Biology Training Program NCI CA193200 (E.B.) e un generoso dono senza restrizioni da parte di Joseph e Lucille Madri.
Materials
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11029 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11035 | |
| B27 Supplement | Gibco, Waltham, MA, USA | 17504-044 | |
| bFGF | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | PHG0263 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647 | |
| BX43 microscope | Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan | ||
| DAPI stain | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | D1306 | |
| Dispase | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 07913 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11330-032 | |
| DPBS | Gibco, Waltham, MA, USA | 10010023 | |
| FluroSave | MilliporeSigma, Burlington, MA | 345789 | |
| GFAP antibody | NeuroMab, Davis, CA | N206A/8 | |
| Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) | Corning, Corning, NY, USA | 356231 | |
| H9 hESCs | WiCell, Madison, WI, USA | WA09 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 9041-08-1 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708880 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708891 | |
| L-glutamine | Gibco, Waltham, MA, USA | 25030-081 | |
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M6145 | |
| mTESR media | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 85850 | |
| N2 NeuroPlex | Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA | 400-163 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ND-2000 | |
| NEAA | Gibco, Waltham, MA, USA | 11140-050 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
| OCT | Sakura Finetek, Torrance, CA, USA | 25608-930 | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | RT15710 | |
| qPCR machine | Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA | 1855196 | |
| RNeasy kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| Sox2 | MilliporeSigma, Burlington, MA | AB5603 | |
| TMS-F microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787-100ML | |
| Ultra-low attachment T75 flasks | Corning, Corning, NY, USA | 3814 |
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