طريقة ثابتة ذاتية التوجيه لتوليد الأعضاء الدماغية من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية
Summary
تم إنشاء هذا البروتوكول كوسيلة لإنتاج organoids الدماغ بطريقة مبسطة ومنخفضة التكلفة دون عوامل النمو الخارجية أو مصفوفة غشاء الطابق السفلي مع الحفاظ على تنوع أنواع خلايا الدماغ والعديد من ميزات التنظيم الخلوي.
Abstract
توفر أجهزة الدماغ المميزة عن الخلايا الجذعية الجنينية فرصة فريدة لدراسة التفاعلات المعقدة لأنواع الخلايا المتعددة في نظام ثلاثي الأبعاد. هنا نقدم طريقة واضحة نسبيا وغير مكلفة أن تسفر عن organoids الدماغ. في هذا البروتوكول يتم تقسيم الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات إلى مجموعات صغيرة بدلاً من الخلايا المفردة وتزرع في الوسائط الأساسية دون مصفوفة غشاء الطابق السفلي غير المغايرة أو عوامل النمو الخارجية ، مما يسمح للإشارات التنموية الجوهرية لتشكيل نمو العضوي. هذا النظام البسيط ينتج مجموعة متنوعة من أنواع خلايا الدماغ بما في ذلك الخلايا الدبقية والدقيقة، والخلايا الجذعية، والخلايا العصبية من الدماغ الأمامي، منتصف الدماغ، والدماغ الخلفي. Organoids ولدت من هذا البروتوكول أيضا عرض السمات المميزة للتنظيم المناسب الزمانية والمكانية التي أظهرتها الصور brightfield ، الأنسجة ، الفلور المناعي والوقت الحقيقي الكمية عكس النسخ البوليميراز تفاعل سلسلة ( qRT-PCR). لأن هذه الاعضاء تحتوي على أنواع الخلايا من أجزاء مختلفة من الدماغ، ويمكن استخدامها لدراسة العديد من الأمراض. على سبيل المثال، في ورقة حديثة أظهرنا استخدام الأورجادات الاعضاء المتولدة من هذا البروتوكول لدراسة آثار نقص الأكسجة على الدماغ البشري. يمكن استخدام هذا النهج للتحقيق في مجموعة من الحالات التي يصعب دراستها مثل الإعاقات العصبية النمائية والاضطرابات الوراثية والأمراض العصبية.
Introduction
بسبب عدد لا يحصى من القيود العملية والأخلاقية، كان هناك قدر كبير من الصعوبة في دراسة الدماغ البشري. في حين أن الدراسات التي تستخدم القوارض كانت حاسمة لفهمنا للدماغ البشري ، فإن دماغ الفأر لديه العديد من أوجه الاختلاف1،2. ومن المثير للاهتمام أن الفئران لديها كثافة عصبية أقل بـ 7 مرات على الأقل من دماغ الرئيسيات3و4. على الرغم من أن الرئيسيات أقرب إلى البشر من القوارض من وجهة نظر تطورية ، إلا أنه ليس من العملي لمعظم الباحثين العمل معهم. وكان الغرض من هذا البروتوكول لتلخيص العديد من السمات الهامة للدماغ البشري باستخدام طريقة مبسطة وأقل تكلفة دون الحاجة إلى مصفوفة غشاء الطابق السفلي غير مغاير أو عوامل النمو الخارجية مع الحفاظ على تنوع خلايا الدماغ والتنظيم الخلوي.
استخدم العمل التكويني من مختبر Sasai الثقافة الحرة للخلايا الجنينية (SFEBq) لتوليد أنواع الخلايا العصبية ثنائية وثلاثية الأبعاد من الخلايا الجذعية الجنينية (ESCs)5،6. وقد اتبعت العديد من أساليب الأعضاء في الدماغ البشري مسارا مماثلا نسبيا من ESCs الإشارات7،8. في المقابل ، يبدأ هذا البروتوكول مع مجموعات من ESCs البشرية المنفصلة (hESCs) ، على غرار الخطوات الأولية للعمل المنوي لمختبرات طومسون وتشانغ قبل خطوات الطلاء9،10 وكذلك الخطوة الأولية لبروتوكول الجهاز في الدماغ من مختبر باسكا قبل إضافة عوامل النمو الخارجية11. وقد استخدمت مصفوفات غشاء الطابق السفلي (على سبيل المثال، matrigel) في العديد من بروتوكولات الأجهزة الدماغية، وقد ثبت أن تكون سقالة فعالة8. ومع ذلك ، فإن مصفوفات غشاء الطابق السفلي الأكثر استخدامًا لا تأتي دون مضاعفات لأنها تشارك في تنقية كميات غير معروفة من عوامل النمو مع تقلب الدفعة أثناء الإنتاج12. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لهذه المصفوفات تعقيد التصوير ، وزيادة خطر التلوث والتكلفة.
في حين يمكن استخدام الأجهزة الاعضاء في الدماغ البشري للإجابة على العديد من الأسئلة، وهناك بعض القيود التي يجب أن تضع في اعتبارها. لأحد، بدءا من الخلايا الجذعية الجنينية، وorganoids تشبه بشكل وثيق العقول غير ناضجة من العقول القديمة وعلى هذا النحو قد لا تكون نماذج مثالية للأمراض التي تحدث في سن الشيخوخة، مثل مرض الزهايمر. ثانيا، في حين أن بروتوكولنا وجدت علامات من الدماغ الأمامي، منتصف الدماغ وتطور الدماغ الخلفي التي هي مفيدة لدراسة تأثير العلاج أو المرض على الخلايا من مناطق الدماغ متعددة في الحفل، يمكن اتباع بروتوكولات أخرى للتركيز على مناطق الدماغ محددة13،14. وأخيرا ، فإن هناك قيدا آخر من النماذج organoid هو أن من الحجم ، في حين أن متوسط طول الدماغ البشري ما يقرب من 167 ملم ، organoids الدماغ المصنوعة باستخدام التحريض تنمو تصل إلى 4 ملم8 وorganoids التي شكلتها هذا البروتوكول تنمو إلى 1-2 ملم من قبل 10 أسابيع. ومع ذلك، يوفر هذا البروتوكول أداة هامة لدراسة أنسجة الدماغ البشري والتفاعل بين أنواع الخلايا المتعددة.
Protocol
Representative Results
Discussion
على غرار النماذج الاعضاء الأخرى، وهذا هو نظام اصطناعي الذي يأتي مع العديد من المحاذير. على الرغم من أنه كان هناك القليل دفعة إلى دفعة الاختلاف من حيث مستويات التعبير العام، organoids الفردية لم تظهر الاختلافات. على سبيل المثال ، لم يكن موقع المناطق الإيجابية Sox-2 متطابقًا في كل عضو(الشكل 3).</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر نواة الخلايا الجذعية في جامعة ييل (YSCC) ومركز ييل للسرطان (YCC) على المساعدة. نشكر الدكتور جونغ كيم على استعراضه لعلم الأمراض العصبية. تم دعم هذا العمل من قبل صندوق أبحاث الطب التجديدي في ولاية كونيتيكت، ومارس من الدايمات، وNHLBI R01HL131793 (S.G.K.)، ومركز ييل للسرطان وبرنامج ييل للتدريب على بيولوجيا السرطان NCI CA193200 (E.B.) وهدية سخية غير مقيدة من جوزيف و لوسيل مادري
Materials
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11029 | |
| Alexa Fluor 546 goat anti-rabbit | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | A11035 | |
| B27 Supplement | Gibco, Waltham, MA, USA | 17504-044 | |
| bFGF | Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | PHG0263 | |
| BSA | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | A9647 | |
| BX43 microscope | Olympus, Shinjuku, Tokyo, Japan | ||
| DAPI stain | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | D1306 | |
| Dispase | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 07913 | |
| DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | 11330-032 | |
| DPBS | Gibco, Waltham, MA, USA | 10010023 | |
| FluroSave | MilliporeSigma, Burlington, MA | 345789 | |
| GFAP antibody | NeuroMab, Davis, CA | N206A/8 | |
| Growth Factor Reduced Matrigel (Matrix) | Corning, Corning, NY, USA | 356231 | |
| H9 hESCs | WiCell, Madison, WI, USA | WA09 | |
| Heparin | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | 9041-08-1 | |
| iQ SYBR Green Supermix | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708880 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | Bio-Rad, Hercules, CA, USA | 1708891 | |
| L-glutamine | Gibco, Waltham, MA, USA | 25030-081 | |
| Monothioglycerol | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | M6145 | |
| mTESR media | STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada | 85850 | |
| N2 NeuroPlex | Gemini Bio Products, West Sacramento, CA, USA | 400-163 | |
| Nanodrop | Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA | ND-2000 | |
| NEAA | Gibco, Waltham, MA, USA | 11140-050 | |
| Normal Donkey Serum (NDS) | ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, PA, USA | 017-000-121 | |
| OCT | Sakura Finetek, Torrance, CA, USA | 25608-930 | |
| PFA | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | RT15710 | |
| qPCR machine | Bio-Rad, CFX96, Hercules, CA, USA | 1855196 | |
| RNeasy kit | Qiagen, Hilden, Germany | 74104 | |
| Sox2 | MilliporeSigma, Burlington, MA | AB5603 | |
| TMS-F microscope | Nikon, Melville, NY, USA | ||
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA | T8787-100ML | |
| Ultra-low attachment T75 flasks | Corning, Corning, NY, USA | 3814 |
References
- Northcutt, R. G. Understanding vertebrate brain evolution. Integrative and Comparative Biology. 42 (4), 743-756 (2002).
- Roth, G. . The Long Evolution of Brains and Minds. , (2013).
- Herculano-Houzel, S. The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain. Frontiers in Human Neuroscience. 3, 31 (2009).
- Roth, G., Dicke, U. Evolution of the brain and intelligence. Trends in Cognitive Sciences. 9 (5), 250-257 (2005).
- Eiraku, M., et al. Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals. Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).
- Watanabe, K., et al. Directed differentiation of telencephalic precursors from embryonic stem cells. Nature Neuroscience. 8 (3), 288-296 (2005).
- Kadoshima, T., et al. Self-organization of axial polarity, inside-out layer pattern, and species-specific progenitor dynamics in human ES cell-derived neocortex. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (50), 20284-20289 (2013).
- Lancaster, M. A., et al. Cerebral organoids model human brain development and microcephaly. Nature. 501 (7467), 373-379 (2013).
- Li, X. J., et al. Specification of motoneurons from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 23 (2), 215-221 (2005).
- Zhang, S. C., Wernig, M., Duncan, I. D., Brustle, O., Thomson, J. A. In vitro differentiation of transplantable neural precursors from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 19 (12), 1129-1133 (2001).
- Pasca, A. M., et al. Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture. Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Qian, X., et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell. 165 (5), 1238-1254 (2016).
- Sloan, S. A., Andersen, J., Pasca, A. M., Birey, F., Pasca, S. P. Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures. Nature Protocols. 13 (9), 2062-2085 (2018).
- Kelava, I., Lancaster, M. A. Stem Cell Models of Human Brain Development. Cell Stem Cell. 18 (6), 736-748 (2016).
- Boisvert, E. M., Means, R. E., Michaud, M., Madri, J. A., Katz, S. G. Minocycline mitigates the effect of neonatal hypoxic insult on human brain organoids. Cell Death and Disease. 10 (4), 325 (2019).
- Bergmann, S., et al. Blood-brain-barrier organoids for investigating the permeability of CNS therapeutics. Nature Protocols. 13 (12), 2827-2843 (2018).
- Mansour, A. A., et al. An in vivo model of functional and vascularized human brain organoids. Nature Biotechnology. 36 (5), 432-441 (2018).
- Pham, M. T., et al. Generation of human vascularized brain organoids. Neuroreport. 29 (7), 588-593 (2018).
- Boisvert, E. M., Denton, K., Lei, L., Li, X. J. The specification of telencephalic glutamatergic neurons from human pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments. (74), (2013).
