Fotonik Çip Kullanarak Yüksek İşLeç Toplam İç Yansıma Floresansı ve Direkt Stokastik Optik Rekonstrüksiyon Mikroskobu
Summary
Çip tabanlı süper çözünürlüklü optik mikroskopi floresan mikroskobu için yeni bir yaklaşım dır ve maliyet etkinliği ve iş akışı avantajları sunuyor. Burada TIRF mikroskobu ve lokalizasyon tabanlı süper çözünürlüklü mikroskopi için çip hazırlama ve görüntüleme protokolleri gösterilmiştir.
Abstract
Toplam iç yansıma floresansı (TIRF), optik kesit sayesinde gelişmiş kontrast sağladığından tek moleküllü lokalizasyon tabanlı süper çözünürlüklü mikroskopide yaygın olarak kullanılır. Geleneksel yaklaşım, hem uyarma hem de toplama için yüksek sayısal diyafram mikroskobu TIRF hedefleri kullanmak, görüş ve iş verme alanını ciddi şekilde sınırlamaktır. Çip tabanlı nanoscopy adı verilen optik dalga kılavuzları ile görüntüleme için TIRF uyarma oluşturmaya yeni bir yaklaşım savuruyoruz. Bu protokolün amacı, yonga tabanlı görüntülemenin önceden oluşturulmuş bir kurulumda nasıl gerçekleştirildiğini göstermektir. Çip bazlı nanoscopy’nin en büyük avantajı uyarma ve toplama yollarının ayrılmasıdır. Görüntüleme daha sonra çözünürlükte küçük bir azalma fiyata, görüş TIRF görüntüleri geniş bir alan sonuçlanan, düşük büyütme lens ile yapılabilir. Karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri (LSECs) geleneksel süper çözünürlüklü mikroskoplar ile karşılaştırılabilir bir çözünürlük gösteren, doğrudan stokhastik optik rekonstrüksiyon mikroskopları(dSTORM) kullanılarak görüntülendi. Buna ek olarak, 500 μm x 500 m’lik bir bölgeyi düşük büyütme li lensle görüntüleyerek yüksek üretim özelliklerini gösteriyoruz ve 76 nm çözünürlük sağlıyoruz. Kompakt karakteri sayesinde, çip tabanlı görüntüleme en yaygın mikroskoplar içine güçlendirilmiş olabilir ve diğer çip üzerinde optik teknikleri ile kombine edilebilir, çip algılama gibi, spektroskopi, optik bindirme, vb. Bu nedenle bu teknik, yüksek iş yapma oranı 2B süper çözünürlüklü görüntüleme için idealdir, ancak aynı zamanda çoklu modal analiz için de harika fırsatlar sunar.
Introduction
Tek molekül lokalizasyon mikroskopisi ilk gösteribu yana, birçok varyasyon farklı zorlukları çözmek için geliştirilmiştir1,2,3. Ancak kalan bir sorun, geniş görüş alanı dSTORM görüntüleme. Birçok dSTORM kurulumları hem örnek heyecanlandırmak ve görüntü için aynı objektif lens kullanın. Görüş alanını artırmak için düşük büyütmeli bir merceğe ihtiyaç vardır. Düşük büyütme ve düşük sayısal diyafram (NA) nesnel lensler genellikle geniş bir alan derinliğine sahiptir ve bu da yerelleştirme hassasiyetini azaltacak uçak dışı sinyalin artmasına neden olur. TIRF hedefleri genellikle düzlem dışı floresan azaltarak görüntü kontrastını artırmak için kullanılır. TIRF sayesinde, uyarma bir evanescent alan4ile yüzeyden yaklaşık 150 nm optik kalınlığı ile sınırlıdır. TIRF objektif lensler, büyük bir NA’ya ihtiyaç duyar ve bu da büyük bir görüş alanı (FOV) (örn. 50 x 50 μm2),elde edilen kısmı önemli ölçüde sınırlar. Ancak, bir evanescent alan oluşturmak için alternatif yollar vardır.
Optik dalga kılavuzu, yapıya birleştiğinde ışığı sınırlandıracak ve yönlendirecek bir yapıdır. En yaygın olarak, dalga kılavuzları fiber tabanlı telekomünikasyon kullanılır. Fotonik entegre devrelerin ana bileşeni olarak 2B entegre dalga kılavuzları geliştirmek için büyük çaba gösterilmiştir. Teknoloji, düşük kayıplı nano-yapılandırılmış optik dalga kılavuzları imalatı rutin 5yapılabilirbir noktaya ilerlemiştir. Bugün, dünya çapında çeşitli dökümhaneler fotonik entegre devreler geliştirmek için kullanılabilir. Dalga kılavuzları, ışığı toplam iç yansımada da yüzeyde bir evanescent alanı sergileyen kılavuzolarak yönlendirir. Dalga kılavuzu yapısının dikkatli tasarımı ile, evanescent alanında yüksek yoğunlukelde edilebilir. Böylece dalga kılavuzu yüzeyinin üzerine doğrudan yerleştirilen bir örnek, görüntüleme uygulamaları için evanescent alanı ile de aydınlatılabilir. Evanescent alan dalga kılavuzunun tüm uzunluğu ve genişliği boyunca oluşturulacak, ve böylece keyfi büyük yapılabilir6.
Biz tirf dSTORM için keyfi geniş bir görüş alanı sunan yeni bir yaklaşım sıyoruz. Hem uyarma hem de koleksiyon için TIRF lens kullanmak yerine optik dalga kılavuzlarındaki evanescent alanını kullanarak heyecanlandırıyoruz. Bu, uyarma ve toplama ışık yolunu ayırarak, dalga kılavuzu yongası aydınlatması tarafından sağlanan belirli bir dalga boyu için optik kesitten ödün vermeden toplama ışık yolu boyunca toplam özgürlüğe olanak sağlar. Düşük büyütme lensler böylece TIRF modunda çok büyük bölgeleri görüntü için kullanılabilir, daha küçük bir NA yanal çözünürlüğü azaltacak olsa da. Ayrıca, çok renkli görüntüleme de büyük ölçüde dalga kılavuzları kullanılarak basitleştirilmiş7, çeşitli dalga boyları yönlendirilebilir ve sistem yeniden düzene olmadan tespit edilebilir. Düşük dalga boyları florofon yanıp sönme geliştirmek ve çok renkli görüntüleme için kullanılabilir gibi bu dSTORM için avantajlıdır. Görüntüleme işleminin nasıl gerçekleştirildiğini etkilemese de, evanescent alanının penetrasyon derinliğinin dalga boyu fonksiyonu olarak değişeceğini belirtmekte yarar vardır. Çip canlı hücre görüntüleme8 ile uyumludur ve mikroakışkanların entegrasyonu gibi uygulamalar için idealdir. Her çip, kullanıcının farklı koşullar altında görüntü veya optik bindirme9 ve Raman spektroskopi10 uygulayabilirsiniz dalga kılavuzları, onlarca içerebilir.
Çip tabanlı sistem hem kırınım sınırlı hem de süper çözünürlüklü görüntüleme için eşit derecede iyi çalışır. Benzer bir yaklaşım 2005 yılında evanescent alan uyarma oluşturmak için bir prizma kullanılarak tanıtıldı4. Fotonik çip de evanescent alan aracılığıyla heyecanlandırır, ancak modern dalga kılavuzu üretim teknikleri ile, bir dalga kılavuzları ile egzotik ışık desenleri üretebilir. Mevcut çip tabanlı nanoscopy uygulaması sadece 2D görüntüleme ile sınırlıdır, uyarma alanı dalga kılavuzu yüzeyinin içinde kilitli olduğundan. Gelecekteki geliştirme 3D uygulamaları hedefleyecek. Ayrıca, yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu gibi diğer süper çözünürlüklü teknikler aynı çip tabanlı mikroskop11kullanılarak geliştirilmektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Çip tabanlı görüntüleme geleneksel dSTORM görüntüleme benzer. Böylece görüntü kalitesi geleneksel dSTORM görüntülemeile aynı yaklaşımlar kullanılarak ölçülebilir. Kullanıcı için temel fark şeffaf cam slayt opak bir Si-gofret ile değiştirilir olmasıdır. Çok farklı görünseler de, örnek işleme neredeyse cam bir slayta benzer. Cips oldukça sağlam ve kolayca gofret cımbız kullanılarak ele alınabilir. Görüntüleme prosedürü ve görüntü rekonstrüksiyonu normal bir dSTORM deneyinde olduğu gibi aynıdır. İşlevsel çip tabanlı bir mikroskop kurmak, fotonik yongalar dışında özel bileşenler gerektirmez. Kurulum daha fazla bilgi önceki çalışmada bulunabilir6,7. Bu çalışmada kullanılan yongalar standart fotolitografi8kullanılarak imal edilmiştir.
Numune hazırlama, numune haznesinin hazırlanmasını kapsar. PDMS çerçevesini çipe takarken, havanın girebileceği küçük kıvrımlardan veya yırtıklardan kaçınmak çok önemlidir. PDMS takarken katlanırsa, bir cızırdaya dikkatlice çıkarın ve yeniden takın. Numune PDMS odası içinde hazır olduğunda, kapak camı ona bastırılmalı ve bölgeyi mühürlemelidir. Bu coverglass takArak oluşabilir herhangi bir hava kabarcıkları önlemek için önemlidir. Bir hava kabarcığı oluşursa, kapak camı nazikçe çıkarın ve numunenin kapalı olduğundan emin olmak için örnek haznesine PBS ekleyin. Kapak fişinin hazırlanması ve eki daha sonra yeniden yapılabilir.
Bu kağıtta önerilen protokol kullanılarak dalga kılavuzuna ışık bağlama basitleştirilir. Ancak, bağlantı sınırlandırabilecek birkaç ortak sorun vardır. İlk olarak, çip düzgün bir şekilde temizlenmemişse ve arta kalan Herhangi bir PBS tamamen çıkarılmışsa, dalga kılavuzunda kir veya kristalize PBS olabilir. Bu görüntüleme bölgesinde çok az güç ile sonuçlanan, büyük kayıplara neden olabilir. Kapak camı dışında bölgeyi temizlemek için nemli bir bez kullanarak önemli ölçüde güç artırabilir. İkinci olarak, dalga kılavuzunun bağlantı yönü zarar görürse (örneğin, yanlış kullanım la), bağlantı kaybı büyük ölçüde artabilir. Kenarın optik muayenesi genellikle kolayca herhangi bir zarar ortaya çıkaracaktır. Çipin tüm bağlantı falı dikkatle parlatılmış olabilir, optik fiber gibi, ve pürüzsüz bir kaplin falı verecek, daha sonra birleştiğinde güç artar.
Işık birleştiğinde, görüntüleme prosedürü herhangi bir geleneksel dSTORM kurulum aynıdır. Şekil 2A’dagösterildiği gibi görüntüde homojen uyarma varsa, büyük olasılıkla ortalama mod iyi çalışmamıştır. Bunun en yaygın iki nedeni şunlardır: 1) ortalama bir yığın oluşturmak için yakalanan çok az görüntü ve 2) bir salınım mesafesi çok kısa / çok büyük bir adım boyutu. Çok az görüntü toplama bazı uyarma desenleri dışarı bırakabilirsiniz ve ortalama böylece homojen olacaktır. Bu, ortalama yığındaki görüntü sayısını artırarak kolayca çözülebilir. Salınım mesafesinin çok kısa lığı da homojen olmayan bir görüntüye neden olabilir, çünkü yeterli mod deleği heyecanlı değildir. Bu da kolayca salınım mesafesi artırarak ve / veya adım boyutu azaltarak çözülebilir. Bu çalışmada 20 μm üzerinde giriş lazer ışını tarayabilir ve en az 300 görüntü elde piezo sahne kullandık. Başka bir yaklaşım, 10-30 ms. Bu seçenek, hücre altı organellerin sürekli hareket halinde olduğu canlı hücre TIRF görüntülemesi için uygundur.
Çip tabanlı dSTORM, yüksek iş elde görüntüleme için ideal hale getiren eşi görülmemiş geniş bir TIRF uyarma sunar. Kompakt karakter, ters kurulumlar için çipin baş aşağı yerleştirilebildiği veya saydam yüzeylerin geliştirilebileceği ticari sistemlere güçlendirme olanağı sağlar. Cips toplu imal ve birçok ihtiyaca uyacak şekilde değiştirilebilir. Şu anda, ana kısıtlama 2D ile sınırlı olmasıdır. Evanescent alan dalga kılavuzu yüzeyinden sadece yaklaşık 200 nm uzakta mevcuttur, bu yüzden bu bölgede sadece florofores heyecanlı olacak. Entegre optik alanı, yeni görüntüleme sorularıyla başa çıkmanın yanı sıra mevcut olanlara yeni olanaklar sunarak yakın gelecekte çip tabanlı mikroskopi için birçok fırsat sunmaktadır.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Avrupa Araştırma Konseyi’ni (B.S.A.’ya verilen 336716 sayılı bağış) kabul etmek isterler. Yazarlar ayrıca irati Lagfragua kayıt ve video düzenleme ile onu paha biçilmez yardım için teşekkür etmek istiyorum.
Materials
| 1-axis sample stage | Standa | 7T173-20 | |
| 2-axis sample translation stage | Mad City Labs | Custom order | |
| 3-axis NanoMax stage | Thorlabs | MAX311D | |
| BXFM microscope body | Olympus | OLY-LSM-037018 | |
| CellMask Deep Red, Life technologies | ThermoFisher | C10046 | |
| Cleanroom grade swabs | MRC Technology | MFS-758 | |
| Fiber-coupled laser | Cobolt | Flamenco | |
| Filter Holder | Homemade | ||
| Hellmanex III, Hellma Gmbh | Sigma-Aldrich | Z805939 | Cleaning detergent concentrate |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935-1L | |
| KL 1600 LED | Olympus | OLY-LSM-E0433314 | |
| Olympus Coupling lens | Olympus | LMPLFLN 50x/0.5 | |
| Orca Flash 4.0 V2 | Hamamatsu | ||
| PBS tablets | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | Mix according to descriptions |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer 1.1 kg kit | Dow | 1673921 | |
| Tip-tilt stage | Thorlabs | APR001 | |
| Vacuum holder | Thorlabs | HWV001 | |
| Wafer Tweezers Type 2W | Agar scientific | AGT5051 |
References
- Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nature Methods. 5 (6), 527-529 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
- Wazawa, T., Ueda, M. Total internal reflection fluorescence microscopy in single molecule nanobioscience. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 77-106 (2005).
- Jalali, B., Fathpour, S. Silicon photonics. Journal of Lightwave Technology. 24 (12), 4600-4615 (2006).
- Helle, &. #. 2. 1. 6. ;. I., Coucheron, D. A., Tinguely, J. C., Øie, C. I., Ahluwalia, B. S. Nanoscopy on-a-chip: super-resolution imaging on the millimeter scale. Optics Express. 27 (5), 6700-6710 (2019).
- Diekmann, R., et al. Chip-based wide field-of-view nanoscopy. Nature Photonics. 11 (5), 322-328 (2017).
- Tinguely, J. C., Helle, &. #. 2. 1. 6. ;. I., Ahluwalia, B. S. Silicon nitride waveguide platform for fluorescence microscopy of living cells. Optics Express. 25 (22), 27678-27690 (2017).
- Ahluwalia, B. S., McCourt, P., Huser, T., Hellesø, O. G. Optical trapping and propulsion of red blood cells on waveguide surfaces. Optics Express. 18 (20), 21053-21061 (2010).
- Coucheron, D. A., Wadduwage, D. N., Murugan, G. S., So, P. T. C., Ahluwalia, B. S. Chip-Based Resonance Raman Spectroscopy Using Tantalum Pentoxide Waveguides. IEEE Photonics Technology Letters. 31 (14), 1127-1130 (2019).
- Structured illumination microscopy using a photonic chip. ArXiV Available from: https://arxiv.org/abs/1903.05512v1 (2019)
- Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Archetti, A., Glushkov, E., Sieben, C., Stroganov, A., Radenovic, A., Manley, S. Waveguide-PAINT offers an open platform for large field-of-view super-resolution imaging. Nature Communications. 10, (2019).
- Braet, F., Wisse, E. Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review. Comparative Hepatology. 1, 1 (2002).
