Высокопроходимых Всего внутреннего отражения флуоресценции и прямой стохастической оптической реконструкции микроскопии с помощью фотонического чипа
Summary
Оптическая микроскопия на основе микросхем на основе суперразрешения является новым подходом к флуоресценции и предлагает преимущества в экономической эффективности и пропускной способности. Здесь показаны протоколы подготовки и визуализации чипов для микроскопии TIRF и микроскопии на основе локализации суперразрешения.
Abstract
Полная внутренняя флуоресценция отражения (TIRF) обычно используется в одной молекуле локализации на основе супер-разрешения микроскопии, как это дает повышенный контраст из-за оптического сечения. Обычный подход заключается в использовании высокочисленных диафрагмы микроскопа TIRF целей как для возбуждения и сбора, серьезно ограничивая поле зрения и пропускной их. Мы представляем новый подход к генерации TIRF возбуждение для визуализации с оптическими волноводами, называется чип основе наноскопии. Цель юга в этом протоколе состоит в том, чтобы продемонстрировать, как изображение на основе чипов выполняется в уже построенной установке. Основным преимуществом наноскопии на основе чипов является то, что пути возбуждения и сбора разъединяются. Изображение может быть сделано с низким увеличением объектива, в результате чего большое поле зрения TIRF изображения, по цене небольшого сокращения разрешения. Синусоидальные эндотелиальные клетки печени (LSECs) были изображены с помощью прямой стохастической оптической реконструкции микроскопии(dSTORM), показывая разрешение, сравнимое с традиционными микроскопами супер-разрешения. Кроме того, мы демонстрируем высокопроизводительные возможности, изображая область 500 мкм х 500 мкм с объективом с низким увеличением, обеспечивая разрешение 76 нм. Благодаря своему компактспособному характеру, чип-изображение может быть переоборудовано в наиболее распространенные микроскопы и может быть объединено с другими оптическими методами на чипе, такими как зондирование на чипе, спектроскопия, оптическое улавливание и т.д. Таким образом, техника идеально подходит для высокой пропускной способности 2D супер-разрешение изображения, но и предлагает большие возможности для мульти-модального анализа.
Introduction
С момента первоначальной демонстрации одной молекулы локализации микроскопии, многие варианты были разработаны для решения различных проблем1,2,3. Одна из проблем, которая остается, однако, большое поле зрения dSTORM изображений. Многие установки dSTORM используют один и тот же объективный объектив как для возбуждения образца, так и для его изображения. Для увеличения поля зрения необходим объектив с низким увеличением. Низкое увеличение и низкие численные диафрагмы (NA) объективные линзы, как правило, имеют большую глубину ранты, что приводит к увеличению вне плоскости сигнала, что позволит снизить точность локализации. Цели TIRF обычно используются для увеличения контраста изображения за счет уменьшения флуоресценции вне плана. Через TIRF, возбуждение ограничивается оптической толщиной около 150 нм от поверхности с помощью evanescent поле4. Объективные линзы TIRF требуют большого NA, что приводит к небольшому поле зрения (FOV) (например, 50 х 50 мкм2),что значительно ограничивает пропускную стоимость. Однако существуют альтернативные способы создания evanescent поля.
Оптический волнодуд представляет собой структуру, которая будет ограничивать и направлять свет, если он связан с структурой. Чаще всего волноводы используются в волоконно-телекоммуникационной связи. Были приложены большие усилия для того, чтобы разработать 2D интегрированные волноводы в качестве основного компонента фотонных интегральных схем. Технология продвинулась до точки, где изготовление низкой потери нано-структурированных оптических волнообразов можно регулярно сделать5. Сегодня несколько литейных заводов по всему миру могут быть использованы для разработки фотонных интегральных схем. Waveguides направлять свет через полное внутреннее отражение также экспонирование evanescent поле на поверхности. Тщательное проектирование волноугной структуры, высокая интенсивность может быть достигнута в области эвакуации. Образец, помещенный непосредственно на поверхность волновода, может быть также освещен evanescent полем для применения изображений. Evanescent поле будет генерироваться по всей длине и ширине волновода, и, таким образом, это может быть сделано произвольно большой6.
Мы представляем новый подход к TIRF dSTORM, который предлагает произвольно большое поле зрения. Вместо того, чтобы использовать объектив TIRF как для возбуждения, так и для сбора, мы возбуждаем с помощью evanescent поля от оптических волнообразов. Это отделяет возбуждение и сбор световой путь, что позволяет полную свободу вдоль пути сбора света без ущерба для оптического сечения для данной длины волны, предоставляемой волнорезом чипа освещения. Таким образом, линзы с низким увеличением могут использоваться для изображения очень больших регионов в режиме TIRF, хотя меньший NA уменьшит боковое разрешение. Кроме того, многоцветная визуализация также значительно упрощается с помощью волногидов7,так как несколько длин волн можно направлять и обнаруживать без стративания системы. Это выгодно для dSTORM, так как низкие длины волн могут быть использованы для повышения флюорофора мигает и для многоцветной визуализации. Стоит отметить, что глубина проникновения evanescent поля будет меняться как функция длины волны, хотя это не влияет на то, как процедура визуализации выполняется. Чип совместим с живой визуализацией клеток8 и идеально подходит для таких приложений, как интеграция микрофлюиди. Каждый чип может содержать десятки волногов, которые могут позволить пользователю изображения в различных условиях или применять оптические захвата9 и Роман спектроскопии10.
Система на основе чипов одинаково хорошо работает как для дифракционной, так и для сверхразрешения изображений. Аналогичный подход был введен в 2005 году с использованием призмы для создания evanescent возбуждение поля4. Фотонический чип также возбуждает через evanescent поле, но с современными методами изготовления волновода, можно генерировать экзотические световые узоры с волноводами. Нынешняя реализация наноскопии на основе чипов ограничивается только 2D-изображением, так как волнообразное поле запирается внутри поверхности волноугина. Будущая разработка будет направлена на 3D-приложения. Кроме того, другие методы супер-разрешения, такие как структурированная микроскопия освещения, разрабатываются с использованием того же микроскопа на основе чипа11.
Protocol
Representative Results
Discussion
Чип-изображение похоже на обычные изображения dSTORM. Таким образом, качество изображения можно оценить с помощью тех же подходов, что и для традиционной изображения dSTORM. Основное отличие пользователя заключается в том, что прозрачная стеклянная горка обменивается непрозрачным Si-wafer. Хотя они выглядят очень разные, обработка образца практически аналогична стеклянной горке. Чипы довольно прочные и могут быть легко обработаны с помощью вафельное пинцет. Процедура визуализации и реконструкция изображения такая же, как и в обычном эксперименте dSTORM. Настройка функционального микроскопа на основе чипов не требует специальных компонентов, кроме фотонных чипов. Более подробную информацию о настройке можно найти в предыдущей работе6,7. Чипы, используемые в этой работе, были изготовлены с помощью стандартной фотолитографии8.
Подготовка образцов включает в себя подготовку выборочной камеры. При подключении кадра PDMS к чипу, очень важно, чтобы избежать каких-либо небольших складок или рипы, где воздух может войти. Если PDMS складывается при его крепления, просто удалить его тщательно с пинцетом и прикрепить его. Когда образец готов внутри камеры PDMS, крышка должна быть прижата к нему, герметичная область. Важно избегать пузырьков воздуха, которые могут образовываться при крепении крышки. Если пузырь воздуха образуется, аккуратно снимите стекло и добавьте PBS в камеру образца, чтобы убедиться, что образец покрыт. Подготовка и вложение крышки скольжения может быть просто переделать.
Соединение света в волногид упрощается с помощью протокола, предложенного в настоящем документе. Есть, однако, несколько общих проблем, которые могут ограничить связь. Во-первых, если чип не был очищен должным образом и любые остатки PBS удалены полностью, может быть грязь или кристаллизованные PBS на волноуг. Это может привести к значительным потерям, что приводит к очень малоэнергии в области визуализации. Использование влажного тампона для очистки области за пределами крышки стекла может значительно улучшить мощность. Во-вторых, если парагвальная грань волновода повреждена (например, при неправильной обработке), потеря соединения может резко возрасти. Оптический осмотр края, как правило, выявить любые повреждения легко. Вся грани соединения чипа может быть отполирована тщательно, так же, как оптическое волокно, и даст гладкую грани соединения, которая затем увеличивает цепь.
После того, как свет был соединен, процедура визуализации такая же, как и в любой обычной установке dSTORM. Если изображение имеет неоднородное возбуждение, как показано на рисунке 2А,то, скорее всего, усреднение режима не работает хорошо. Двумя наиболее распространенными причинами этого являются: 1) слишком мало изображений, захваченных для того, чтобы создать средний стек и 2) слишком короткий расстояние колебаний / слишком большой размер шага. Сбор слишком мало изображений может оставить некоторые образцы возбуждения и в среднем, таким образом, будет неоднородным. Это можно легко решить, увеличив количество изображений в среднем стеке. Слишком короткое расстояние колебаний может также привести к неоднородному изображению, так как недостаточное количество шаблонов режимов возбуждается. Это также может быть легко решена путем увеличения расстояния колебаний и / или уменьшения размера шага. В этой работе мы использовали сцену пьезо для сканирования вхотливого лазерного луча более 20 мкм и приобретения не менее 300 изображений. Другой подход может заключаться в использовании высокоскоростных галво-зеркал для сканирования света через входной волнообразной фаши в течение одного времени приобретения, например, 10-30 мс. Этот вариант подходит для визуализации тизины живых клеток TIRF, где субклеточные органеллы находятся в постоянном движении.
Чип-основанный dSTORM предлагает беспрецедентную большую площадь TIRF возбуждение, что делает его идеально подходит для высокой пропускной работы изображений. Компактный символ позволяет переоборудовать сядок в коммерческие системы, где чип можно разместить с ног на голову для перевернутых установок или прозрачных субстратов. Чипы являются массовыми изготовлены и могут быть изменены в соответствии со многими потребностями. В настоящее время основным ограничением является то, что оно ограничено 2D. Evanescent поле доступно только около 200 нм от поверхности волнорез, так что только фторфоры в этой области будут рады. В целом, область интегрированной оптики предлагает много возможностей для микроскопии на основе чипов в ближайшем будущем, решая новые вопросы визуализации, а также предоставляя новые возможности для существующих.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы отметить Европейский исследовательский совет (грант No 336716 B.S.A.). Авторы также хотели бы поблагодарить Ирати Лагфрагуа за ее неоценимую помощь в записи и редактировании видео.
Materials
| 1-axis sample stage | Standa | 7T173-20 | |
| 2-axis sample translation stage | Mad City Labs | Custom order | |
| 3-axis NanoMax stage | Thorlabs | MAX311D | |
| BXFM microscope body | Olympus | OLY-LSM-037018 | |
| CellMask Deep Red, Life technologies | ThermoFisher | C10046 | |
| Cleanroom grade swabs | MRC Technology | MFS-758 | |
| Fiber-coupled laser | Cobolt | Flamenco | |
| Filter Holder | Homemade | ||
| Hellmanex III, Hellma Gmbh | Sigma-Aldrich | Z805939 | Cleaning detergent concentrate |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935-1L | |
| KL 1600 LED | Olympus | OLY-LSM-E0433314 | |
| Olympus Coupling lens | Olympus | LMPLFLN 50x/0.5 | |
| Orca Flash 4.0 V2 | Hamamatsu | ||
| PBS tablets | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | Mix according to descriptions |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer 1.1 kg kit | Dow | 1673921 | |
| Tip-tilt stage | Thorlabs | APR001 | |
| Vacuum holder | Thorlabs | HWV001 | |
| Wafer Tweezers Type 2W | Agar scientific | AGT5051 |
References
- Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nature Methods. 5 (6), 527-529 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
- Wazawa, T., Ueda, M. Total internal reflection fluorescence microscopy in single molecule nanobioscience. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 77-106 (2005).
- Jalali, B., Fathpour, S. Silicon photonics. Journal of Lightwave Technology. 24 (12), 4600-4615 (2006).
- Helle, &. #. 2. 1. 6. ;. I., Coucheron, D. A., Tinguely, J. C., Øie, C. I., Ahluwalia, B. S. Nanoscopy on-a-chip: super-resolution imaging on the millimeter scale. Optics Express. 27 (5), 6700-6710 (2019).
- Diekmann, R., et al. Chip-based wide field-of-view nanoscopy. Nature Photonics. 11 (5), 322-328 (2017).
- Tinguely, J. C., Helle, &. #. 2. 1. 6. ;. I., Ahluwalia, B. S. Silicon nitride waveguide platform for fluorescence microscopy of living cells. Optics Express. 25 (22), 27678-27690 (2017).
- Ahluwalia, B. S., McCourt, P., Huser, T., Hellesø, O. G. Optical trapping and propulsion of red blood cells on waveguide surfaces. Optics Express. 18 (20), 21053-21061 (2010).
- Coucheron, D. A., Wadduwage, D. N., Murugan, G. S., So, P. T. C., Ahluwalia, B. S. Chip-Based Resonance Raman Spectroscopy Using Tantalum Pentoxide Waveguides. IEEE Photonics Technology Letters. 31 (14), 1127-1130 (2019).
- Structured illumination microscopy using a photonic chip. ArXiV Available from: https://arxiv.org/abs/1903.05512v1 (2019)
- Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Archetti, A., Glushkov, E., Sieben, C., Stroganov, A., Radenovic, A., Manley, S. Waveguide-PAINT offers an open platform for large field-of-view super-resolution imaging. Nature Communications. 10, (2019).
- Braet, F., Wisse, E. Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review. Comparative Hepatology. 1, 1 (2002).
