Fluorescência de reflexão interna total de alta taxa de transferência e microscopia de reconstrução óptica estocástica direta usando um chip fotônico
Summary
Microscopia óptica baseada em chip é uma nova abordagem à microscopia de fluorescência e oferece vantagens na relação custo-eficácia e taxa de transferência. Aqui, os protocolos de preparação e imagem de chips são mostrados para microscopia tirf e microscopia de super-resolução baseada em localização.
Abstract
A fluorescência total da reflexão interna (TIRF) é comumente usada em microscopia de superresolução baseada em localização de molécula única, pois dá maior contraste devido à secção óptica. A abordagem convencional é usar objetivos de tirf de microscópio de abertura numérica alta para excitação e coleta, limitando severamente o campo de visão e a produção. Apresentamos uma nova abordagem para gerar excitação tirf para imagens com guias de onda óptica, chamado de nanoscopia baseada em chip. O objetivo deste protocolo é demonstrar como a imagem de imagem baseada em chip é realizada em uma configuração já construída. A principal vantagem da nanoscopia baseada em chip é que as vias de excitação e coleta são dissociadas. A imagem pode então ser feita com uma lente de baixa ampliação, resultando em grandes imagens de campo de visão da TIRF, ao preço de uma pequena redução na resolução. As células endotélias endotélias sinusoidal hepáticas (LSECs) foram imagemdas usando microscopia de reconstrução óptica estocástica direta (dSTORM), mostrando uma resolução comparável aos microscópios tradicionais de superresolução. Além disso, demonstramos as capacidades de alta taxa de rendimento por imagem de uma região de 500 μm x 500 μm com uma lente de baixa ampliação, fornecendo uma resolução de 76 nm. Através de seu caráter compacto, imagens baseadas em chip podem ser adaptadas em microscópios mais comuns e podem ser combinadas com outras técnicas ópticas no chip, como sensoriamento no chip, espectroscopia, armadilha óptica, etc. A técnica é, portanto, ideal para alta geração de imagens de super-resolução 2D, mas também oferece grandes oportunidades para análise multimodal.
Introduction
Desde a demonstração inicial da microscopia de localização de molécula única, muitas variações foram desenvolvidas para resolver diferentes desafios1,2,3. Um desafio que permaneceu, no entanto, é o grande campo de visão de imagem dSTORM. Muitas configurações dSTORM usam a mesma lente objetiva para excitar a amostra e imaginá-la. A fim de aumentar o campo de visão, uma lente de baixa ampliação é necessária. As lentes objetivas de baixa ampliação e baixa abertura numérica (NA) geralmente têm uma grande profundidade de campo, resultando em um sinal maior fora do plano que reduzirá a precisão da localização. Os objetivos da TIRF são comumente usados para aumentar o contraste de imagem, reduzindo a fluorescência fora do avião. Através da TIRF, a excitação é limitada a uma espessura óptica de aproximadamente 150 nm da superfície por meio de um campo evanescente4. As lentes objetivas da TIRF exigem um grande NA, resultando em um pequeno campo de visão (FOV) (por exemplo, 50 x 50 μm2),o que limita significativamente a taxa de produção. Há, no entanto, maneiras alternativas de gerar um campo evanescente.
Um guia óptico de onda é uma estrutura que irá confinar e guiar a luz se for acoplado à estrutura. Mais comumente, guias de onda são usados em telecomunicações à base de fibra. Grande esforço tem sido feito para desenvolver guias de onda integrados 2D como um componente principal dos circuitos integrados fotônicos. A tecnologia avançou a um ponto onde a fabricação de guias de onda ópticos estruturados nano-estruturados de baixa perda pode ser feito rotineiramente5. Hoje, várias fundições em todo o mundo podem ser usadas para desenvolver circuitos integrados fotônicos. Guias de ondas guiam a luz através da total reflação interna também exibindo um campo evanescente na superfície. Pelo projeto cuidadoso da estrutura do waveguide, uma intensidade elevada pode ser conseguida no campo evanescente. Uma amostra colocada diretamente no topo da superfície do guia de onda também pode ser iluminada pelo campo evanescente para aplicações de imagem. O campo evanescente será gerado ao longo de todo o comprimento e largura do guia de onda, e, portanto, pode ser feito arbitrariamente grande6.
Apresentamos uma nova abordagem à TIRF dSTORM que oferece um campo de visão arbitrariamente grande. Em vez de usar uma lente TIRF para excitação e coleta, nós excitamos usando o campo evanescente de guias de onda ópticos. Isso desacoplar a extensão de luz de excitação e coleta, permitindo a liberdade total ao longo do caminho de luz da coleção sem comprometer a secção óptica para um determinado comprimento de onda fornecido pela iluminação do chip waveguide. Lentes de baixa ampliação podem, assim, ser usadas para imagem regiões muito grandes no modo TIRF, embora um NA menor reduza a resolução lateral. Além disso, a imagem multicolorida também é muito simplificada usando guias de onda7,já que vários comprimentos de onda podem ser guiados e detectados sem reajustar o sistema. Isto é vantajoso para dTEMPESTADE, porque os baixos comprimentos de onda podem ser usados para realçar o fluorophore que pisca e para a imagem latente multicolor. Vale a pena notar que a profundidade de penetração do campo evanescente mudará em função do comprimento de onda, embora não afete a forma como o procedimento de imagem é realizado. O chip é compatível com imagens de células vivas8 e é ideal para aplicações como a integração de microfluídicos. Cada chip pode conter dezenas de guias de onda, que podem permitir que o usuário se aimagem em diferentes condições ou aplicar armadilhas ópticas9 e espectroscopia Raman10.
O sistema baseado em chip funciona igualmente bem para imagens limitadas por difração e superresolução. Uma abordagem semelhante foi introduzida em 2005 usando um prisma para gerar a excitação evanescente de campo4. O chip fotônico também excita através do campo evanescente, mas com técnicas modernas de fabricação de guias de onda, pode-se gerar padrões de luz exóticos com guias de onda. A atual implementação de nanoscopia baseada em chip é limitada apenas a imagens 2D, já que o campo de excitação está bloqueado dentro da superfície do guia de onda. O desenvolvimento futuro terá como objetivo aplicações 3D. Além disso, outras técnicas de super-resolução, como microscopia de iluminação estruturada, estão sendo desenvolvidas usando o mesmo microscópio baseado em chip11.
Protocol
Representative Results
Discussion
A imagem latente chip-baseada é similar à imagem latente convencional da TEMPESTADE do d. A qualidade da imagem pode, assim, ser medida usando as mesmas abordagens que para a imagem tradicional dSTORM. A principal diferença para o usuário é que o slide de vidro transparente é trocado com um Si-wafer opaco. Embora pareçam muito diferentes, a manipulação da amostra é praticamente análoga a uma corrediça de vidro. As microplaquetas são completamente resistentes e podem facilmente ser seguradas usando pinças da bolacha. O procedimento de imagem e reconstrução de imagem é o mesmo que em um experimento regular dSTORM. A configuração de um microscópio funcional baseado em chip não requer componentes especiais, exceto para os chips fotônicos. Mais detalhes da configuração podem ser encontrados no trabalho anterior6,7. Os chips usados neste trabalho foram fabricados usando fotolitografia padrão8.
A preparação da amostra abrange a preparação da câmara da amostra. Ao anexar o quadro PDMS ao chip, é crucial evitar pequenas dobras ou rasgos onde o ar pode entrar. Se o PDMS dobra ao anexá-lo, basta removê-lo cuidadosamente com uma pinça e recolocá-lo. Quando a amostra estiver pronta dentro da câmara PDMS, a cobertura deve ser pressionada contra ela, selando a região. É importante evitar todas as bolhas de ar que possam se formar ao anexar a viólito. Se uma bolha de ar é formada, retire delicadamente o coverglass e adicione PBS à câmara da amostra para assegurar-se de que a amostra esteja coberta. A preparação e o acessório do deslizamento da tampa podem então simplesmente ser repor.
O acoplamento da luz no guia de onda é simplificado usando o protocolo proposto neste artigo. Há, no entanto, alguns desafios comuns que podem limitar o acoplamento. Em primeiro lugar, se o chip não foi limpo corretamente e qualquer sobra PBS removido completamente, pode haver sujeira ou PBS cristalizado no guia de onda. Isso pode introduzir grandes perdas, resultando em muito pouco poder na região de imagem. Usar um cotonete húmido para limpar a região fora do vidro de tampa pode melhorar significativamente o poder. Em segundo lugar, se a faceta do acoplamento do guia de onda for danificada (por exemplo, por manuseio inadequado), a perda de acoplamento pode aumentar drasticamente. Inspeção óptica da borda geralmente irá revelar quaisquer danos facilmente. A faceta de acoplamento inteira da microplaqueta pode ser lustrada com cuidado, bem como uma fibra ótica, e dará uma faceta lisa do acoplamento, que aumente então o poder acoplado.
Depois que a luz foi acoplada, o procedimento da imagem latente é o mesmo que em toda a instalação convencional da tempestade do d. Se a imagem tem excitação inhomogênea, como demonstrado na Figura 2A,então provavelmente a média do modo não funcionou bem. As duas razões mais comuns para isso são: 1) muito poucas imagens capturadas, a fim de criar uma pilha média e 2) muito curto de uma distância de oscilação / muito grande de um tamanho de passo. Coletar muito poucas imagens pode deixar de fora alguns padrões de excitação e, portanto, a média será inhomogênea. Isso pode ser facilmente resolvido aumentando o número de imagens na pilha média. Muito curto de uma distância de oscilação também pode resultar em uma imagem inhomogene, como padrões de modo não é suficiente animado. Isso também pode ser facilmente resolvido aumentando a distância de oscilação e/ou diminuindo o tamanho da etapa. Neste trabalho, usamos uma etapa piezo para digitalizar o feixe de laser de entrada mais de 20 μm e adquirir pelo menos 300 imagens. Outra abordagem poderia ser o uso de galvo-espelhos de alta velocidade para digitalizar a luz através da faceta de guia de onda de entrada dentro de um único tempo de aquisição, como 10-30 ms. Esta opção é adequada para imagens tirf células vivas, onde organelas subcelulares estão em constante movimento.
A dSTORM, com base em chip, oferece uma excitação TIRF de grande área sem precedentes, o que o torna ideal para imagens de alta geração. O caráter compacto permite a adaptação aos sistemas comerciais, onde o chip pode ser colocado de cabeça para baixo para configurações invertidas ou substratos transparentes podem ser desenvolvidos. As microplaquetas são fabricadas em massa e podem ser modificadas para serir muitas necessidades. Atualmente, a principal restrição é que ela seja limitada a 2D. O campo evanescente só está disponível a aproximadamente 200 nm de distância da superfície do guia de ondas, então apenas os fluorofônicos dentro desta região ficarão animados. Ao todo, o campo da óptica integrada oferece muitas oportunidades para microscopia baseada em chip em um futuro próximo, abordando novas questões de imagem, bem como fornecendo novas possibilidades para as existentes.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de reconhecer o Conselho Europeu de Investigação (subvenção nº 336716 à B.S.A.). Os autores também gostariam de agradecer a Irati Lagfragua por sua inestimável assistência com a gravação e edição do vídeo.
Materials
| 1-axis sample stage | Standa | 7T173-20 | |
| 2-axis sample translation stage | Mad City Labs | Custom order | |
| 3-axis NanoMax stage | Thorlabs | MAX311D | |
| BXFM microscope body | Olympus | OLY-LSM-037018 | |
| CellMask Deep Red, Life technologies | ThermoFisher | C10046 | |
| Cleanroom grade swabs | MRC Technology | MFS-758 | |
| Fiber-coupled laser | Cobolt | Flamenco | |
| Filter Holder | Homemade | ||
| Hellmanex III, Hellma Gmbh | Sigma-Aldrich | Z805939 | Cleaning detergent concentrate |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935-1L | |
| KL 1600 LED | Olympus | OLY-LSM-E0433314 | |
| Olympus Coupling lens | Olympus | LMPLFLN 50x/0.5 | |
| Orca Flash 4.0 V2 | Hamamatsu | ||
| PBS tablets | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | Mix according to descriptions |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer 1.1 kg kit | Dow | 1673921 | |
| Tip-tilt stage | Thorlabs | APR001 | |
| Vacuum holder | Thorlabs | HWV001 | |
| Wafer Tweezers Type 2W | Agar scientific | AGT5051 |
References
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