フォトニックチップを用いたハイスループット全内部反射蛍光と直接確率光学再構成顕微鏡

1. ポリジメチルシロキサン(PDMS)層の調製 シルガード184モノマーと硬化剤の10:1ミックスを準備します。 気泡がなくなるまで真空チャンバーに入れます。 3.5インチ(直径)ペトリ皿の中央に1.7gのPDMS混合物を注ぎます。 スピンコーターの真空チャックにペトリ皿を置きます。 900 rpmで20sのペトリ皿をスピンコートし、75 rpm/sの加速を加えます。 50°Cのホットプレートで少なくとも2時間は硬化させます。 2. サンプル調製 導波路洗浄 脱イオン水中に洗浄洗剤濃縮物(材料表)を1%希釈して100mL調製する。 ウエハツイーザーを使用してガラスペトリ皿にチップを入れ、洗剤溶液で完全に覆います。 ペトリ皿を70°Cのホットプレートに10分間置きます。 ホットプレートの上に残したまま、清潔なティッシュ綿棒で表面をこすります。 ペトリ皿からチップを取り出します。少なくとも100mLのDI水ですすします。 イソプロパノールの少なくとも100 mLでリンス、蒸発汚れを防ぐために表面に溶媒が乾燥しないことを注意してください。 少なくとも100mLのDI水ですすします。窒素ガンでチップを乾かします。 チャンバー準備 ペトリ皿に150μmポリジメチルシロキサン(PDMS)の層を調製する(セクション1)。 メスを使用して、PDMS レイヤーから 1.5 cm x 1.5 cm フレームをカットします。 シュイーザーでペトリ皿からフレームを持ち上げます。清潔で磨かれたチップに平らに入れ。これで、サンプルでセルシードの準備ができました。 蛍光標識 リン酸緩衝生理食塩水、染料溶液、dSTORMイメージングバッファーの化学物質を調製します。 細胞のシード処理後、メディアからチップを取り出します。 PDMSチャンバーの外側から余分な液体を除去するには、ピペットを使用します。 約60°LのクリーンPBSを同時に追加しながら、ピペットでPDMSチャンバー内から電流流体を取り出します。注:チャンバーに追加された量は、チャンバーのサイズに応じて変更する必要があります。セル表面からすべてのメディアを取り外さないように注意してください。 PBSを60°LのクリーンPBSに交換し、1分間インキュベートします。 前の手順を繰り返し、今度は 5 分間インキュベートします。 PBSを取り外し、60μLの染料溶液に交換します。サンプルを約15分間インキュベートし、光から遮蔽します。注: この手順は、使用する蛍光色素に応じて大幅に変更する必要があります。私たちは、この実験のための細胞膜にラベルを付けるためにセルマスクディープレッドを使用しています 手順2.3.3-2.3.5のようにPBSでサンプルを洗浄します。 PBSを取り外し、同時に40μLのイメージングバッファに交換します。メモ:異なる蛍光色素に対していくつかの異なるイメージングバッファーがあります。 カバースリップを上に置き、気泡が下に形成されるのを防ぎます。カバースリップを画像室に軽く押して、余分なメディアを取り除きます。 ピペットを使用して、カバースリップの外側にある余分なメディアを取り除きます。乾燥した浸漬媒体残渣によって形成される結晶を避けるために、カバースリップの外側の領域を水湿った綿棒で清掃します。 3. イメージング手順 コンポーネントの設定メモ:このバージョンのセットアップは、顕微鏡、カップリングステージ、サンプルステージの3つの主要コンポーネントで構成されています。「材料表」を参照してください。 フィルターホルダー、白色光源、カメラ、および客観的なリボルバーを備えた顕微鏡を使用してください。 3軸ピエゾカップリングステージには、ファイバー結合レーザーとカップリングレンズを使用してください。 先端と傾きと真空ホルダーを備えた1軸手動サンプルステージを使用してください。 カップリングとサンプルステージの両方を2軸電動ステージに取り付けて、サンプル翻訳を行います。 導波路カップリング カップリングファセットを使用して真空チャックにチップを配置します。チップがカップリング目的から約1焦点距離離れていることを確認します。 真空ポンプの電源を入れます。 レーザーの電源を1mWにします。ビームがエッジに当たるようにチップの高さを大まかに調整します。レーザーの電源を切ります。 白い光源をオンにします。低倍率の対数レンズ(例:10x)を選択します。顕微鏡を導波路に合わせます。 導波路に沿って顕微鏡を移動し、光路と十分に整列しているかどうかを確認します。顕微鏡をカップリングエッジに移動します。 レーザーの電源を1mW以下で切り入れます。レーザー光を見つけるためにカップリングエッジに沿って顕微鏡を移動します。ビームをチップエッジに焦点を合かします。 光路に沿って結合ステージを調整し、レーザー光スポットサイズが消えるまで小さくします。ビームがチップ表面の上または下にあるようになりました。 ビームスポットが再び表示され、最大化されるまで、カップリングステージの高さを調整します。 レーザーが焦点を合わせる場所になるまで、前の 2 つの手順を繰り返します。 焦点を合った場所を目的の導波管に移動します。 焦点を合わせられたビームスポットが見えなくなるように、顕微鏡をエッジから少し離れた場所に移動します。白いライトを消しなさい。 コントラストを調整します。導波路が導いている場合は、導波路に沿った散乱光がはっきりと見えるはずです。 カップリングステージの軸を調整して、散乱光強度を最大化します。レーザーの電源を切ります。 白いライトを点灯します。必要に応じてコントラストを調整します。 イメージング領域に移動します。 回折限定イメージング 目的のイメージング目標に焦点を合わせる。白いライトを消しなさい。 蛍光フィルターを挿入し、レーザーパワーを1mWに回します。 カメラの露出時間を約 100 ミリ秒に設定します。カップリングがまだ最適化されていることを確認します。 イメージング対象の領域を見つけます。ピエゾステージループをオンにして、平均アウトモードを行います。注:50 nmのステップサイズの20μmスキャン範囲は、ほとんどの導波路構造に適しています。 少なくとも300枚の画像をキャプチャします。 仮想スタックを使用して、キャプチャしたイメージ スタックを Fiji に読み込みます。フィジーのイメージメニューから[スタック]と[z-project]を選択します。 投影タイプの平均強度を選択して TIRF 画像を計算します。 dストームイメージング レーザーの電源を 1 mW にし、カメラの露出時間を 30 ミリ秒に設定します。 コントラストとフォーカスを調整します。 点滅が見つかるまでレーザーパワーを上げます。注: エバネッセント フィールドの強度によっては、しばらく時間がかかる場合があります。 サンプルの小さな領域を拡大します。 コントラストを調整します。 いくつかの画像をキャプチャして、点滅が適切に分離されているかどうかを確認します。 最適な点滅のためにカメラの露出時間を調整します。注:点滅の最適化は複雑な作業ですが、適切な文献の多くは12を利用できます。 ピエゾステージループをオンにします。 点滅密度に応じて、少なくとも 30,000 フレームのイメージ スタックを記録します。 dSTORM画像再構成 フィジーを開き、仮想イメージとして d STORM スタックをロードします。 必要に応じてコントラストを調整します。 長方形ツールを使用して、再構築する領域を選択します。 フィジーの雷雨13プラグインで実行分析を開きます。 デバイスに対応する雷雨で基本的なカメラ設定を設定します。残りの既定のパラメーターは、通常は満足です。 再構築を開始します。注: ビューの完全なフィールドでは、ファイル サイズが大きいため、データをサブスタックに分割する必要がある場合があります。 再構築ソフトウェアによって提供されるローカリゼーションリストをフィルタリングして、特定のローカリゼーションを削除します。アップルは、必要に応じて追加のドリフト補正。