כולל תפוקה גבוהה של השתקפות פנימית ומיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי אופטיים באמצעות שבב פוטוני
Summary
מיקרוסקופ אופטי ברזולוציה גבוהה מבוססי שבב הוא גישה מקורית למיקרוסקופיה פלואורסצנטית ומציעה יתרונות ביעילות ובתפוקה. כאן, הפרוטוקולים להכנת השבבים וההדמיה מוצגים עבור מיקרוסקופ TIRF ומיקרוסקופ ברזולוציה סופר מבוססי-לוקליזציה.
Abstract
סה כ השתקפות פנימית השתקפויות (TIRF) משמש בדרך כלל מיקרוסקופ יחיד מבוסס לוקליזציה ברזולוציה סופר מיקרוסקופית כפי שהיא מעניקה ניגודיות משופרת עקב הפרדה אופטית. הגישה המקובלת היא להשתמש במיקרוסקופ מספריים גבוהה הצמצם יעדי TIRF עבור עירור ואיסוף, באופן חמור להגביל את שדה התצוגה ואת התפוקה. אנו מציגים גישה מקורית ליצירת עירור TIRF להדמיה עם מדריכי גל אופטיים, המכונים ננוסקופיה המבוססת על שבב. מטרת פרוטוקול זה היא להדגים כיצד הדמיה מבוססת שבב מבוצעת בכיוונון שנבנה כבר. היתרון העיקרי של הננו-מבוססי שבב הוא כי את הריגוש ואת מסלולים אוסף הם ופרדים. הדמיה לאחר מכן ניתן לעשות עם עדשת הגדלה נמוכה, וכתוצאה מכך שדה גדול של תצוגת תמונות TIRF, במחיר של ירידה קטנה ברזולוציה. Sinusoidal הכבד תאים אנדותל (LSECs) היו תמונות באמצעות מיקרוסקופ שחזור אופטי סטוכסטי אופטית (dסערה), מראה רזולוציה המקבילה מיקרוסקופ סופר ברזולוציה מסורתית. בנוסף, אנו מדגימים את היכולות תפוקה גבוהה על ידי דימות 500 יקרומטר x 500 יקרומטר אזור עם עדשת הגדלה נמוכה, מתן רזולוציה של 76 nm. באמצעות האופי הקומפקטי שלה, הדמיה מבוססי שבב יכול להיות מצויד בתוך מיקרוסקופ הנפוץ ביותר והוא יכול להיות משולב עם טכניקות אופטיות אחרות של שבב, כגון חישת שבב, ספקטרוסקופיה, השמנה אופטית, וכו ‘. הטכניקה היא אפוא מתאים באופן אידיאלי להדמיה גבוהה 2D ברזולוציה סופר, אבל גם מציע הזדמנויות נהדרות עבור ניתוח רב מודאלי.
Introduction
מאז ההפגנה הראשונית של מיקרוסקופ לוקליזציה של מולקולה אחת, וריאציות רבות פותחו כדי לפתור אתגרים שונים1,2,3. אתגר אחד שנשאר, עם זאת, הוא שדה גדול של תצוגת dSTORM הדמיה. רבים הגדרות הסערה dלהשתמש בעדשה אובייקטיבית זהה הן להלהיב את המדגם לדמות אותו. על מנת להגדיל את שדה הראייה, יש צורך בעדשת הגדלה נמוכה. הגדלה נמוכה וצמצם מספרי נמוך (NA) עדשות אובייקטיבי בדרך כלל יש עומק גדול של השדה, וכתוצאה מכך אות מחוץ למטוס שיפחית את דיוק הלוקליזציה. יעדי TIRF משמשים בדרך כלל כדי להגדיל את ניגוד התמונה על-ידי הפחתת הזריחה מהמטוס. דרך TIRF, עירור מוגבל עובי אופטי של כ 150 ננומטר מהמשטח באמצעות שדה אוונסי4. עדשות האובייקטיבי tirf דורשים NA גדול וכתוצאה מכך שדה קטן של תצוגה (fov) (g., 50 x 50 יקרומטר2), אשר מגביל את התפוקה באופן משמעותי. עם זאת, ישנן דרכים חלופיות. ליצירת שדה אוונ,
מדריך גל אופטי הוא מבנה אשר להגביל ולהנחות אור אם הוא מצמידים לתוך המבנה. בדרך כלל, מדריכי גל משמשים בתקשורת מבוססת סיבים. נעשה מאמץ גדול כדי לפתח מדריכי גל משולבים דו-ממדית כמרכיב העיקרי של מעגלים משולבים פוטוני. הטכנולוגיה התקדמה לנקודה שבה בדיית מדריכי-גל אופטיים בעלי הפסד נמוך מובנים ננו ניתן לעשות באופן שגרתי5. כיום, ניתן להשתמש בכמה המייסדים ברחבי העולם כדי לפתח מעגלים משולבים פוטוני. מדריכי גל מדריך אור באמצעות השתקפות פנימית מוחלטת גם מציג שדה אוונקו על פני השטח. באמצעות עיצוב קפדני של מבנה מדריך גל, עוצמה גבוהה ניתן להשיג בשדה אוונקו. מדגם הממוקם ישירות על גבי משטח מדריך גל יכול להיות גם מואר על ידי שדה אוונקו עבור יישומי דימות. שדה האוונקו יופק לאורך כל אורכו ורוחבו של מדריך גל, ולכן ניתן לעשות זאת באופן שרירותי וגדול6.
אנו מציגים גישה מקורית לסופת TIRF dהמציעה שדה ראייה גדול באופן שרירותי. במקום להשתמש בעדשת TIRF לעירור ולאיסוף, אנו מלהיבות את השימוש בשדה האוונסי מכיוון מדריכי גל אופטיים. זה decouples את הריגוש ואת מסלול אור האוסף, המאפשר חופש מוחלט לאורך הנתיב אור האוסף מבלי להתפשר על האבטחה האופטית של אורך גל נתון שסופקו על ידי התאורה מדריך גל ההארה. עדשות הגדלה נמוכה יכול ובכך לשמש התמונה אזורים גדולים מאוד במצב TIRF, למרות NA קטן יותר תפחית את הרזולוציה לרוחב. יתר על כן, הדמיה ססגוניות הוא גם מאוד פשוט מאוד באמצעות מדריכי גל7, כמו כמה אורכי גל יכול להיות מונחה ומזוהה מבלי לקרוא את המערכת. זהו יתרון עבור הסערה d, כמו אורכי גל נמוך ניתן להשתמש כדי לשפר fluorophore מהבהב עבור הדמיה ססגוניות. ראוי לציין כי עומק החדירה של שדה האוונ, ישתנה כפונקציה של אורך הגל, למרות שהוא אינו משפיע על אופן הביצוע של הליך ההדמיה. השבב תואם הדמיה תא חי8 והוא אידיאלי עבור יישומים כגון שילוב של microfluidics מיקרופלואידיקה. כל שבב יכול להכיל עשרות מדריכי גל, אשר יכול לאפשר למשתמש לדמות בתנאים שונים או להחיל השמנה אופטית9 ו ספקטרוסקופיית מראמאן10.
המערכת המבוססת על שבב פועלת היטב גם עבור הדמיה מוגבלת וברזולוציה סופר באופן שווה. גישה דומה הוצגה בשנת 2005 באמצעות מנסרה כדי ליצור את עירור השדה האוונבי4. השבב הפוטוני מלהיב גם באמצעות שדה אוונטון, אבל עם טכניקות מודרניות לייצור גל, ניתן ליצור דוגמאות אור אקזוטיות עם מדריכי גל. היישום הננו מבוסס שבב הנוכחי מוגבל הדמיה 2D בלבד, כמו שדה עירור נעול בתוך משטח המדריך גל. פיתוח עתידי יכוון ליישומים תלת-ממדיים. בנוסף, טכניקות ברזולוציה סופר אחרות כגון מיקרוסקופ תאורה מובנה מפותחים באמצעות אותו מיקרוסקופ שבב מבוסס על-ידי שבבים11.
Protocol
Representative Results
Discussion
הדמיה מבוססת שבב דומה הדמיית הסערה dקונבנציונאלי. איכות התמונה יכול ובכך להיות מגויח באמצעות אותן גישות כמו עבור הדמיה מסורתית הסערה d. ההבדל העיקרי בפני המשתמש הוא ששקופית הזכוכית השקופה מוחלפים באמצעות כופל בורדו. למרות שהם נראים שונים מאוד, הטיפול במדגם הוא למעשה אנלוגי לשקופית זכוכית. השבבים הם חזקים למדי והוא יכול בקלות להיות מטופלים באמצעות מלקחיים וופל. הליך ההדמיה ושחזור התמונה זהה לניסוי בסערה רגילה. הגדרת מיקרוסקופ מבוסס שבב פונקציונלי לא דורש רכיבים מיוחדים, למעט שבבי פוטוני. פרטים נוספים על הגדרת ניתן למצוא בעבודה הקודמת6,7. השבבים המשמשים בעבודה זו הפוברק באמצעות פוטוגרפיה סטנדרטית8.
הכנת הדוגמא מקיפה את הכנת חדר הדגימה. בעת חיבור מסגרת PDMS לשבב, זה חיוני כדי למנוע כל קפלי קטן או קורע איפה האוויר יכול להיכנס. אם pdms קפלי בעת הצמדת אותו, פשוט להסיר אותו בזהירות עם פינצטה ולחבר אותו. כאשר המדגם מוכן בתוך התא PDMS, הcoverglass יש ללחוץ עליו, איטום האזור. חשוב להימנע כל בועות אוויר שעשוי להיווצר בעת חיבור הcoverglass. אם נוצר בועת אוויר, להסיר בעדינות את שמיכות ולהוסיף PBS לחדר לדוגמה כדי להבטיח כי המדגם מכוסה. ההכנה וההחזקה של שובר הכיסוי יכולים פשוט להיות משופץ.
האור הצימוד לתוך מדריך הגל הוא פשוט באמצעות הפרוטוקול המוצע בנייר זה. עם זאת, ישנם כמה אתגרים נפוצים שיכולים להגביל את הצימוד. ראשית, אם השבב לא נוקה כראוי, כל שאריות PBS הוסרו לחלוטין, יכול להיות לכלוך או מגובש PBS על מדריך גל. זה יכול להציג הפסדים גדולים, וכתוצאה מכך מעט מאוד כוח באזור ההדמיה. שימוש בספוגית לח כדי לנקות את האזור מחוץ לזכוכית המכסה יכול לשפר את הכוח באופן משמעותי. שנית, אם ההיבט הצימוד של מדריך גל ניזוק (למשל, על ידי טיפול לא נאות), אובדן הצימוד יכול להגביר באופן דרסטי. בדיקה אופטית של הקצה יגלה בדרך כלל נזקים בקלות. ההיבט הצימוד כולו של השבב יכול להיות מלוטש בזהירות, בדומה סיבים אופטיים, והוא ייתן פן צימוד חלקים, אשר לאחר מכן מגביר את הכוח ביחד.
לאחר שהאור משולב, הליך ההדמיה זהה לכל הגדרות הסערותהרגילות. אם התמונה היא בעלת עירור הומוגניות, כפי שמתואר באיור 2A, סביר להניח שהמצב בממוצע לא עבד היטב. שתי הסיבות השכיחות ביותר לכך הן: 1) מעט מדי תמונות שנתפסו כדי ליצור מחסנית ממוצעת 2) קצר מדי של מרחק תנודה/גדול מדי של גודל השלב. איסוף מעט מדי תמונות יכול להשאיר כמה דפוסי עירור והממוצע יהיה ובכך להיות הומוגנית. ניתן לפתור זאת בקלות על-ידי הגדלת מספר התמונות במחסנית הממוצעת. קצר מדי של מרחק תנודות יכול גם לגרום לתמונה לא הומוגנית, כמו לא מספיק דפוסי מצב מתרגשים. ניתן גם לפתור זאת בקלות על-ידי הגברת מרחק התנודה ו/או הקטנת גודל השלב. בעבודה זו השתמשנו בשלב piezo כדי לסרוק את קרן לייזר קלט מעל 20 יקרומטר ולרכוש לפחות 300 תמונות. גישה אחרת יכולה להיות להשתמש galvo מהירות גבוהה כדי לסרוק את האור על פני ההיבט מדריך גל קלט בתוך זמן הרכישה בודד, כגון 10-30 ms. אפשרות זו מתאימה ליצירת הדמיה של TIRF בשידור חי, היכן שהאורגלים הסלולאריים בתנועה מתמדת.
מבוסס שבב dסטורם מציע אזור גדול חסר תקדים tirf עירור, מה שהופך אותו אידיאלי מתאים לדימות תפוקה גבוהה. הדמות הקומפקטית מאפשרת התאמה למערכות מסחריות, שם ניתן למקם את השבב למטה עבור הגדרות הפוך או מצעים שקופים ניתן לפתח. האסימונים הם מפוברק המוניים ניתן לשנות כדי להתאים לצרכים רבים. כיום, ההגבלה העיקרית היא שהוא מוגבל ל-2D. שדה אוונקו זמין רק כ 200 ננומטר הרחק משטח המדריך גל, אז רק fluorophores בתוך אזור זה יהיה נרגש. לגמרי, תחום האופטיקה המשולבת מציע הזדמנויות רבות עבור מיקרוסקופ מבוסס שבב בעתיד הקרוב, על ידי התמודדות עם שאלות הדמיה חדשות, כמו גם מתן אפשרויות חדשות הקיימות.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מתבקשים להכיר במועצת המחקר האירופאית (למענק מס ‘ 336716 לB.S.A.). המחברים גם רוצה להודות Irati Lagfragua על הסיוע שלה יסולא בפז עם הקלטה ועריכה של וידאו.
Materials
| 1-axis sample stage | Standa | 7T173-20 | |
| 2-axis sample translation stage | Mad City Labs | Custom order | |
| 3-axis NanoMax stage | Thorlabs | MAX311D | |
| BXFM microscope body | Olympus | OLY-LSM-037018 | |
| CellMask Deep Red, Life technologies | ThermoFisher | C10046 | |
| Cleanroom grade swabs | MRC Technology | MFS-758 | |
| Fiber-coupled laser | Cobolt | Flamenco | |
| Filter Holder | Homemade | ||
| Hellmanex III, Hellma Gmbh | Sigma-Aldrich | Z805939 | Cleaning detergent concentrate |
| Isopropanol | Sigma-Aldrich | 563935-1L | |
| KL 1600 LED | Olympus | OLY-LSM-E0433314 | |
| Olympus Coupling lens | Olympus | LMPLFLN 50x/0.5 | |
| Orca Flash 4.0 V2 | Hamamatsu | ||
| PBS tablets | Sigma-Aldrich | P4417-50TAB | Mix according to descriptions |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer 1.1 kg kit | Dow | 1673921 | |
| Tip-tilt stage | Thorlabs | APR001 | |
| Vacuum holder | Thorlabs | HWV001 | |
| Wafer Tweezers Type 2W | Agar scientific | AGT5051 |
References
- Juette, M. F., et al. Three-dimensional sub-100 nm resolution fluorescence microscopy of thick samples. Nature Methods. 5 (6), 527-529 (2008).
- Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy. Science. 319 (5864), 810-813 (2008).
- Lampe, A., Haucke, V., Sigrist, S. J., Heilemann, M., Schmoranzer, J. Multi-colour direct STORM with red emitting carbocyanines. Biology of the Cell. 104 (4), 229-237 (2012).
- Wazawa, T., Ueda, M. Total internal reflection fluorescence microscopy in single molecule nanobioscience. Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology. 95, 77-106 (2005).
- Jalali, B., Fathpour, S. Silicon photonics. Journal of Lightwave Technology. 24 (12), 4600-4615 (2006).
- Helle, &. #. 2. 1. 6. ;. I., Coucheron, D. A., Tinguely, J. C., Øie, C. I., Ahluwalia, B. S. Nanoscopy on-a-chip: super-resolution imaging on the millimeter scale. Optics Express. 27 (5), 6700-6710 (2019).
- Diekmann, R., et al. Chip-based wide field-of-view nanoscopy. Nature Photonics. 11 (5), 322-328 (2017).
- Tinguely, J. C., Helle, &. #. 2. 1. 6. ;. I., Ahluwalia, B. S. Silicon nitride waveguide platform for fluorescence microscopy of living cells. Optics Express. 25 (22), 27678-27690 (2017).
- Ahluwalia, B. S., McCourt, P., Huser, T., Hellesø, O. G. Optical trapping and propulsion of red blood cells on waveguide surfaces. Optics Express. 18 (20), 21053-21061 (2010).
- Coucheron, D. A., Wadduwage, D. N., Murugan, G. S., So, P. T. C., Ahluwalia, B. S. Chip-Based Resonance Raman Spectroscopy Using Tantalum Pentoxide Waveguides. IEEE Photonics Technology Letters. 31 (14), 1127-1130 (2019).
- Structured illumination microscopy using a photonic chip. ArXiV Available from: https://arxiv.org/abs/1903.05512v1 (2019)
- Metcalf, D. J., Edwards, R., Kumarswami, N., Knight, A. E. Test Samples for Optimizing STORM Super-Resolution Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Ovesný, M., Křížek, P., Borkovec, J., Švindrych, Z., Hagen, G. M. ThunderSTORM: a comprehensive ImageJ plug-in for PALM and STORM data analysis and super-resolution imaging. Bioinformatics. 30 (16), 2389-2390 (2014).
- Archetti, A., Glushkov, E., Sieben, C., Stroganov, A., Radenovic, A., Manley, S. Waveguide-PAINT offers an open platform for large field-of-view super-resolution imaging. Nature Communications. 10, (2019).
- Braet, F., Wisse, E. Structural and functional aspects of liver sinusoidal endothelial cell fenestrae: a review. Comparative Hepatology. 1, 1 (2002).
