Etiquetado e imágenes de placas amiloideas en el tejido cerebral utilizando la curcumina de polifenoles naturales
Summary
La curcumina es un fluoróforo ideal para el etiquetado y la toma de imágenes de placas de proteína beta amiloide en el tejido cerebral debido a su unión preferencial a la proteína beta amiloide, así como sus similitudes estructurales con otros colorantes de unión amiloide tradicionales. Se puede utilizar para etiquetar e imágenes de placas de proteína beta amiloide de manera más eficiente y económica que los métodos tradicionales.
Abstract
La deposición de la proteína beta amiloide (A) en espacios extra e intracelulares es una de las patologías distintivas de la enfermedad de Alzheimer. Por lo tanto, la detección de la presencia de A en el tejido cerebral AD es una herramienta valiosa para el desarrollo de nuevos tratamientos para prevenir la progresión de la AD. Se han utilizado varios colorantes clásicos de unión amiloide, fluorocromo, sondas de imagen y anticuerpos específicos de A- para detectar histoquímicamente A en el tejido cerebral AD. El uso de estos compuestos para la detección de A es costoso y consume mucho tiempo. Sin embargo, debido a su intensa actividad fluorescente, alta afinidad y especificidad para A, así como similitudes estructurales con los colorantes tradicionales de unión amiloide, la curcumina (Cur) es un candidato prometedor para el etiquetado y la toma de imágenes de placas de A en postmortem tejido cerebral. Es un polifenol natural de la hierba Curcuma longa. En el presente estudio, Cur se utilizó para etiquetar histoquímicamente placas A- tanto de un modelo genético de ratón de la enfermedad de Alzheimer 5x familial (5xFAD) como del tejido AD humano en un minuto. La capacidad de etiquetado de Cur se comparó con los colorantes de unión amiloide convencionales, como el tioflavina-S (Thio-S), el rojo del Congo (CR) y el Fluoro-jade C (FJC), así como con los anticuerpos específicos de A- (6E10 y A11). Observamos que Cur es la forma más económica y rápida de etiquetar e imágenes de placas A- en comparación con estos colorantes convencionales y es comparable a los anticuerpos específicos de A. Además, Cur se une a la mayoría de las especies de A, como los oligómeros y las fibrillas. Por lo tanto, Cur podría ser utilizado como el agente de detección de fluorocromo más rentable, simple y rápido para placas A.
Introduction
La enfermedad de Alzheimer es uno de los trastornos neurológicos progresivos más comunes, relacionados con la edad y una de las principales causas de muerte en todo el mundo1,2. El aprendizaje, la memoria y el deterioro de la cognición, junto con los trastornos neuropsiquiátricos, son los síntomas comunes manifestados en ad3. Aunque la etiología de la AD no ha sido completamente aclarada, la evidencia genética, bioquímica y experimental disponible indica que la deposición gradual de A es un biomarcador definitivo para AD4. Esta proteína minimizada se acumula en espacios intracelulares y extracelulares y se cree que está implicada en la pérdida sináptica, aumento de la neuroinflamación y neurodegeneración en las regiones corticales y del hipocampo en el cerebro afectado por el centro de la enfermedad5. Por lo tanto, la detección histoquímica de A en el tejido AD es un primer paso crucial en el desarrollo de fármacos antiamiloides no tóxicos para prevenir la progresión de la AD.
Durante las últimas décadas, varios colorantes y anticuerpos han sido utilizados por muchos laboratorios de investigación para etiquetar e imágenes de placas A en el tejido cerebral, pero algunos de estos métodos consumen mucho tiempo y los colorantes o anticuerpos utilizados son caros, lo que requiere varios accesorios Productos químicos. Por lo tanto, el desarrollo de un medio barato de detección de placas A en el cerebro AD sería una nueva herramienta bienvenida. Muchos laboratorios comenzaron a utilizar Cur, un prometedor polifenol natural antiamiloide, para el etiquetado y la imagen A, así como un agente terapéutico para AD6,7,8,9. Su hidrofobicidad y naturaleza lipolólica, similitudes estructurales con colorantes clásicos de unión amiloide, fuerte actividad fluorescente, así como una fuerte afinidad para unirse con A, lo convierten en un fluoróforo ideal para el etiquetado y la toma de imágenes de placas A- en el tejido AD10 . Cur se une a las placas y oligómeros A- y su presencia también se detecta en los espacios intracelulares7,11,12,13. Además, se ha demostrado que cantidades mínimas (1-10 nM) de Cur pueden etiquetar placas a a en 5 x tejido cerebral de la enfermedad de Alzheimer familiar (5xFAD)7. Aunque la concentración de 1 nM no proporciona la intensidad de fluorescencia óptima para el recuento de placas de A, una concentración de 10 nM o superior de Cur sí lo hace. Ran y sus colegas14 informaron que dosis tan bajas como 0,2 nM de Cur difluoroboron-derivatizado pueden detectar depósitos in vivo A, casi así como una sonda infrarroja. Aún no está claro si esta dosis es suficiente para etiquetar las placas a a- en el tejido. La mayoría de los estudios previos han utilizado de 20 a 30 minutos para manchar placas de A con Cur, pero la tinción óptima puede requerir mucho menos tiempo.
El presente estudio fue diseñado para probar el tiempo mínimo requerido por Cur para etiquetar las placas a-a en el tejido cerebral AD y para comparar la sensibilidad para el etiquetado y la toma de imágenes de placas A en el tejido cerebral de los ratones 5xFAD después de manchar con Cur con otros Colorantes de unión A, como Thioflavin-S (Thio-S), rojo congoso (CR) y Fluoro-jade C (FJC). La capacidad de etiquetado A de estos colorantes clásicos de unión amiloide se comparó con la tinción de Cur en secciones cerebrales coronales incrustadas en parafina y criostatos de ratones 5xFAD y de AD humano emparejados con edad y tejido cerebral de control. Los hallazgos sugieren que Cur etiqueta las placas A- de una manera similar a los anticuerpos específicos de A – (6E10) y moderadamente mejor que Thio-S, CR, o FJC. Además, cuando se administraron inyecciones intraperitoneales de ratones Cur a 5xFAD durante 2 a 5 días, cruzó la barrera hematoencefálica y se une con placasA- 7. Curiosamente, las concentraciones nanomolares de Cur se han utilizado para etiquetar e imágenes de placas A en el tejido cerebral 5xFAD7,14. Por otra parte, las placas morfológicamente distintas de A, como las placas de núcleo, néríticas, difusas y quemadas pueden ser etiquetadas por Cur de manera más eficiente que con cualquiera de los otros colorantes de unión amiloide convencionales7. En general, Cur se puede aplicar a las placas de la etiqueta y de la imagen a-A en el tejido cerebral postmortem de los modelos animales AD y/o tejido AD humano de una manera fácil y barata, como una alternativa confiable a los anticuerpos específicos de A.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nuestra hipótesis era que Cur podría ser utilizado como la forma más rápida, más fácil y menos costosa de etiquetar e imágenes de placas A en el tejido cerebral postmortem AD en comparación con otros colorantes clásicos de unión amiloide, así como anticuerpos específicos de A. Los objetivos de este estudio fueron determinar el tiempo mínimo necesario para etiquetar e imágenes de placas A- por Cur en el tejido cerebral postmortem AD y determinar si Cur puede ser utilizado como una alternativa al anticuerpo A…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El apoyo a este estudio vino del Instituto de Neurociencias de Campo en ascensión de Santa María.
Materials
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | IHC world, Woodstock, MD | ||
| Aanimal model of Alzheimer's disease | Jackson's laboratory, Bar Harbor, ME | ||
| Absolute alcohol | VWR,Radnor, PA | ||
| Alexa 594 | Santacruz Biotech, Dallas, TX | ||
| Antibody 6E10 | Biolegend, San Diego, CA | ||
| Antibody A11 | Millipore, Burlington, MA | ||
| Compound light microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus BX51 | |
| Congo red | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Cryostat | GMI, Ramsey, MN | LeicaCM1800 | |
| Curcumin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Disodium hydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Dystyrene plasticizer xylene | BDH, Dawsonville, GA | ||
| Filter papers | Fisher scientific, Pittsburgh, PA | ||
| Hoechst-33342 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Inverted fluorescent microscope | Leica, Buffalo Grove, IL | Leica DMI 6000B | |
| Inverted fluorescent microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus 1×70 | |
| Normal goat serum | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraffin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraformaldehyde | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Ploy-lysine coated charged glass slide | Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ | ||
| Potassium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium azide | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium hydroxide | EMD Millipore, Burlington, MA | ||
| Sodium pentobarbital | Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI | ||
| Thioflavin-S | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Triton-X-100 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Xylene | VWR,Radnor, PA |
References
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