Rotulagem e imagem de placas amilóides no tecido cerebral usando a curcumina polifenóis naturais
Summary
A curcumina é um fluorofifora ideal para rotulagem e imagem de placas de proteína beta amilóide no tecido cerebral devido à sua ligação preferencial à proteína beta amilóide, bem como suas semelhanças estruturais com outros corantes de ligação amilóide tradicionais. Ele pode ser usado para rotular e imagem placas de proteína beta amilóide de forma mais eficiente e barata do que os métodos tradicionais.
Abstract
A deposição da proteína beta amilóide (Aβ) em espaços extra e intracelulares é uma das patologias marcantes da doença de Alzheimer (DA). Portanto, a detecção da presença de Aβ no tecido cerebral da DA é uma ferramenta valiosa para o desenvolvimento de novos tratamentos para evitar a progressão da DA. Vários corantes clássicos de ligação amilóide, fluorocromático, sondas de imagem e anticorpos específicos de Aβ têm sido usados para detectar Aβ histoquimicamente no tecido cerebral da DA. O uso desses compostos para detecção de Aβ é caro e demorado. No entanto, devido à sua intensa atividade fluorescente, alta afinidade e especificidade para Aβ, bem como semelhanças estruturais com corantes tradicionais de ligação amilóide, a curcumina (Cur) é um candidato promissor para rotulagem e imagem de placas Aβ em pós-morte tecido cerebral. É um polifenóis natural da erva Curcuma longa. No presente estudo, Cur foi usado para rotular histoquimicamente as placas de Aβ de um modelo genético de camundongos 5x da doença de Alzheimer familiar (5xFAD) quanto do tecido humano da DA em um minuto. A capacidade de rotulagem de Cur foi comparada aos corantes de ligação amilóide convencionais, como tialavina-S (Thio-S), Congo vermelho (CR) e Fluoro-jade C (FJC), bem como anticorpos específicos de Aβ (6E10 e A11). Observamos que cur é a maneira mais barata e mais rápida de rotular e imagem placas Aβ quando comparado a esses corantes convencionais e é comparável aos anticorpos específicos aβ. Além disso, Cur se liga com a maioria das espécies aβ, como oligomers e fibrilas. Portanto, cur poderia ser usado como o mais rentável, simples e rápido agente de detecção fluorocromática para placas Aβ.
Introduction
A doença de Alzheimer (DA) é uma das mais comuns, relacionadas à idade, distúrbios neurológicos progressivos e uma das principais causas de morte em todo o mundo1,2. Aprendizagem, memória e deficiência de cognição, juntamente com distúrbios neuropsiquiátricos, são os sintomas comuns manifestados em3d.A. . Embora a etiologia da DA não tenha sido totalmente elucidada, as evidências genéticas, bioquímicas e experimentais disponíveis indicam que a deposição gradual de Aβ é um biomarcador definitivo para4dC. Esta proteína mal dobrada se acumula em espaços intracelulares e extracelulares e é pensado para estar envolvido na perda sináptica, aumento da neuroinflamação, e neurodegeneração nas regiões corticais e hipocampais no cérebro afetado sd5. Portanto, a detecção histoquímica de Aβ no tecido da DA é um primeiro passo crucial no desenvolvimento de medicamentos anti-amilóides não tóxicos para evitar a progressão da DA.
Durante as últimas décadas, vários corantes e anticorpos têm sido usados por muitos laboratórios de pesquisa para rotular e imagem placas Aβ no tecido cerebral, mas alguns desses métodos são demorados e os corantes ou anticorpos utilizados são caros, exigindo vários acessórios Produtos químicos. Portanto, o desenvolvimento de um meio barato de detecção de placas Aβ no cérebro da DA seria uma nova ferramenta bem-vinda. Muitos laboratórios começaram a utilizar cur, um promissor polifenol natural anti-amilóide, para rotulagem e imagem Aβ, bem como um agente terapêutico paraAD 6,7,8,9. Sua hidrofóbica e natureza lipofilia, semelhanças estruturais com corantes de ligação amilóide clássico, forte atividade fluorescente, bem como forte afinidade para se ligar com Aβ torna um fluorofofóbico ideal para rotulagem e imagem de placas Aβ no tecido ad10 . A coalhada se liga com placas e oligomeros aβ e sua presença também é detectada nos espaços intracelulares7,11,12,13. Além disso, tem sido demonstrado que quantidades mínimas (1-10 nM) de Cur podem rotular placas Aβ na doença de Alzheimer 5x (5xFAD) tecido cerebral7. Embora a concentração de 1 nM não forneça a intensidade ideal da fluorescência para contar de chapas de Aβ, uma concentração de 10 nM ou mais elevada de Cur faz. Ran e colegas14 relataram que doses tão baixas quanto 0,2 nM de cur derivada difluoroboron pode detectar in vivo aβ depósitos quase tão bem como uma sonda infravermelha. Se esta dose é suficiente para rotular placas Aβ no tecido ainda não está claro. A maioria dos estudos anteriores usou 20 a 30 min para colorir placas Aβ usando Cur, mas a coloração ideal pode exigir muito menos tempo.
O presente estudo foi projetado para testar o tempo mínimo exigido pela Cur para rotular placas Aβ no tecido cerebral da DA e comparar a sensibilidade para rotulagem e imagem de placas Aβ no tecido cerebral dos camundongos 5xFAD após colorir com Cur com outros Corantes de ligação a aβ, como Thioflavin-S (Thio-S), Congo vermelho (CR) e Fluoro-jade C (FJC). A capacidade de rotulagem aβ desses corantes de ligação amilóide clássicas foi comparada com a coloração de Cur em seções de cérebro coronal de parafina e criostata de camundongos 5xFAD e de dad humana com correspondência com idade e controle do tecido cerebral. Os resultados sugerem que Cur rotula as placas de Aβ de uma forma semelhante aos anticorpos específicos de Aβ (6E10) e moderadamente melhor do que Thio-S, CR ou FJC. Além disso, quando as injeções intraperitoneal de Cur para camundongos 5xFAD foram administradas por 2 a 5 dias, ela cruzou a barreira sangue-cérebro e encadernada com placas Aβ7. Curiosamente, concentrações nanomolar de Cur têm sido usados para rotular e imagem placas Aβ em 5xFAD tecido cerebral7,14. Além disso, placas aβ morfologicamente distintas, como placas de núcleo, neuritic, difusas e queimadas podem ser rotuladas por Cur de forma mais eficiente do que com qualquer uma das outras tinturas de ligação amilóide convencionais7. No geral, cur pode ser aplicado para rotular e imagem placas Aβ no tecido cerebral pós-morte de modelos animais da DA e / ou tecido da DA humana de uma forma fácil e barata, como uma alternativa confiável para anticorpos específicos Aβ.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nossa hipótese era que cur poderia ser usado como a maneira mais rápida, mais fácil e menos cara para rotular e imagem placas Aβ no tecido cerebral pós-morte da aD quando comparado a outros corantes clássicos de ligação amilóide, bem como anticorpos específicos aβ. Os objetivos deste estudo foram determinar o tempo mínimo necessário para rotular e imagem placas Aβ por Cur no tecido cerebral pós-morte ad e determinar se Cur pode ser usado como uma alternativa ao anticorpo Aβ para rotular placas Aβ. Para e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O apoio a este estudo veio do Instituto de Neurociências de Campo da Ascensão de Santa Maria.
Materials
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | IHC world, Woodstock, MD | ||
| Aanimal model of Alzheimer's disease | Jackson's laboratory, Bar Harbor, ME | ||
| Absolute alcohol | VWR,Radnor, PA | ||
| Alexa 594 | Santacruz Biotech, Dallas, TX | ||
| Antibody 6E10 | Biolegend, San Diego, CA | ||
| Antibody A11 | Millipore, Burlington, MA | ||
| Compound light microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus BX51 | |
| Congo red | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Cryostat | GMI, Ramsey, MN | LeicaCM1800 | |
| Curcumin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Disodium hydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Dystyrene plasticizer xylene | BDH, Dawsonville, GA | ||
| Filter papers | Fisher scientific, Pittsburgh, PA | ||
| Hoechst-33342 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Inverted fluorescent microscope | Leica, Buffalo Grove, IL | Leica DMI 6000B | |
| Inverted fluorescent microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus 1×70 | |
| Normal goat serum | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraffin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraformaldehyde | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Ploy-lysine coated charged glass slide | Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ | ||
| Potassium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium azide | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium hydroxide | EMD Millipore, Burlington, MA | ||
| Sodium pentobarbital | Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI | ||
| Thioflavin-S | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Triton-X-100 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Xylene | VWR,Radnor, PA |
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