תיוג והדמיה של שלטי עמילואיד ברקמת המוח באמצעות פוליפנול טבעי כורכומין
Summary
כורכומין הוא fluorophore האידיאלי עבור תיוג והדמיה של שלטי החלבון ביתא עמילואיד ברקמת המוח בשל הכריכה המועלת שלה לחלבון ביתא עמילואיד, כמו גם הדמיון המבני שלה עם אחרים מאגד עמילואיד מסורתי צבעים. זה יכול לשמש התווית ביתא עמילואיד התמונה לוחיות החלבון ביעילות רבה יותר מאשר שיטות מסורתיות.
Abstract
התצהיר של חלבון בטא עמילואיד (Aβ) בחללים נוספים ו תאיים הוא אחד הפתווגיות בעלי ההיכר של מחלת אלצהיימר (AD). לכן, זיהוי נוכחות של Aβ ברקמת המוח לספירה הוא כלי רב ערך לפיתוח טיפולים חדשים כדי למנוע את ההתקדמות של AD. מספר כריכת עמילואיד הקלאסי, fluorochrome, הדמיה בדיקה, ו נוגדנים ספציפיים Aβ שימשו כדי לזהות היסטלוכימית Aβ ברקמת המוח לספירה. השימוש תרכובות אלה עבור זיהוי Aβ הוא יקר זמן רב. עם זאת, בגלל פעילות פלורסנט אינטנסיבי שלה, אהדה גבוהה, וספציפיות עבור Aβ, כמו גם קווי דמיון מבניים עם כריכת עמילואיד מסורתיים הצבעים, כורכומין (Cur) הוא מועמד מבטיח תיוג והדמיה של שלטי Aβ בנתיחה שלאחר המוות . רקמת מוח זה פוליפנול טבעי מן העשב Curcuma longa. במחקר הנוכחי, שימש נוכחי תווית היסטAβ לוחיות שלטים ממודל העכבר הגנטי של מחלת אלצהיימר 5x משפחתית (5Xאופנה) ומרקמת האדם האנושי בתוך דקה. יכולת התיוג של נוכחי הושווה לצבעי עמילואיד קונבנציונליים, כגון thioflavin-S (Thio-S), קונגו האדום (CR), ו פלואורו-ג’ייד C (FJC), כמו גם נוגדנים ספציפיים Aβ (6E10 ו A11). הבחנו כי הנוכחי הוא הדרך הזולה ביותר והמהירה ביותר כדי לתייג ולצלם את הפלאק Aβ בהשוואה לצבעים אלה קונבנציונאלי והוא דומה לנוגדנים ספציפיים Aβ. בנוסף, הוא נקשר עם רוב המינים Aβ, כגון oligomers ו fibrils. לכן, הנוכחי יכול לשמש כסוכן החסכוני ביותר, פשוט, ומהיר fluorochrome לזיהוי עבור הפלאק Aβ.
Introduction
מחלת אלצהיימר (AD) היא אחת הנפוצות ביותר, הקשורות לגיל, הפרעות נוירולוגיות מתקדמת ואחד הגורמים המובילים של המוות ברחבי העולם1,2. למידה, זיכרון וליקויי קוגניציה, יחד עם הפרעות נפשיות, הן התסמינים השכיחים הנראים לספירה3. למרות האטיולוגיה של AD לא היה מובהר לחלוטין, הראיות הגנטיות, הביוכימי, וניסיוני מציין כי ההצהרה הדרגתית של Aβ הוא ביוארקר מוחלט עבור AD4. חלבון זה מקופל מצטבר בחללים תאיים ומחלוניים והוא נחשב להיות מעורב באובדן סינפטית, מוגברת דלקת נוירו, ו ניוון נוירוטיות באזורי היפוקמאל במוח המושפע על ידי AD5. לכן, גילוי היסטכימיות של Aβ ברקמת AD הוא צעד ראשון מכריע בפיתוח לא רעילים, תרופות נגד עמילואיד כדי למנוע התקדמות AD.
במהלך העשורים האחרונים, מספר צבעים ונוגדנים שימשו על ידי מעבדות מחקר רבות כדי תווית ותמונה Aβ פלאק ברקמת המוח, אבל כמה שיטות אלה הם זמן רב, צבע או נוגדנים בשימוש הם יקרים, הדורשים מספר אביזר כימיקלים. לכן, פיתוח של אמצעי זול לגילוי של שלטי Aβ במוח המודעה יהיה כלי מבורך חדש. מעבדות רבות החלו להשתמש Cur, מבטיח אנטי עמילואיד טבעי polyphenol, עבור תיוג והדמיה Aβ, כמו גם סוכן טיפולי עבור AD6,7,8,9. ההידרופוטוליטי והטבע הלינופילית, קווי דמיון מבניים עם צבעי עמילואיד קלאסיים, פעילות פלורסנט חזקה, כמו גם זיקה חזקה לאגד עם Aβ עושה את זה במיוחד fluorophore לתיוג והדמיה של שלטי Aβ ברקמת לספירה10 . נוכחי נקשר עם Aβ-לוחות oligomers ונוכחותו מזוהה גם בחללים תאיים7,11,12,13. בנוסף, זה הוכח כי כמויות מינימליות (1-10 ננומטר) של נוכחי יכול לסמן Aβ שלטים במחלת אלצהיימר משפחתית 5x (5Xתחביב) רקמת המוח7. למרות הריכוזיות 1 ננומטר אינו מספק את עוצמת הקרינה האופטימלית לספירת שלטים Aβ, 10 ננומטר או ריכוז גבוה יותר של נוכחי עושה. רן ועמיתיו14 דיווחו כי מינונים נמוכים כמו 0.2 ננומטר של difluoroboron-לעבוד על הvivo Aβ פיקדונות כמעט כמו גם בדיקה אינפרא אדום. אם מינון זה מספיק כדי תווית Aβ שלטים ברקמה עדיין לא ברור. רוב המחקרים הקודמים השתמשו 20-30 דקות לצביעת לוחיות Aβ באמצעות Cur, אך כתמים אופטימליים עשוי לדרוש הרבה פחות זמן.
המחקר הנוכחי תוכנן כדי לבדוק את הזמן המינימלי הנדרש על ידי Cur כדי תווית Aβ פלאק ברקמת המוח לספירה וכלה להשוות את הרגישות לתיוג והדמיה של שלטי Aβ ברקמת המוח של העכברים 5xFAD לאחר הצביעת עם נוכחי עם קונבנציונאלי אחרים Aβ-כריכת צבעים, כגון Thioflavin-S (Thio-S), קונגו האדום (CR), ו פלואורו-ג’ייד C (FJC). היכולת תיוג Aβ של אלה הצבעים הקלאסיים עמילואיד מחייב הושווה עם כתמים נוכחי ב פרפין-מוטבע וקריוסטט מקטעים המוח ילתית מן העכברים 5xfad מן הבוגרת התואמת האדם לספירה ושליטה רקמת המוח. הממצאים מראים כי תוויות Cur שלטים Aβ באופן דומה לנוגדנים ספציפיים Aβ (6E10) בינוני טוב יותר מאשר Thio-S, CR, או FJC. בנוסף, כאשר זריקות הצפק של Cur לעכברים 5xFAD היו מנוהלים עבור 2-5 ימים, זה חצה את מחסום הדם-מוח מאוגד עם שלטים Aβ7. מעניין, ריכוזי nanomolar של נוכחי שימשו תוויות ותמונה Aβ פלאק ברקמת מוח 5xfad7,14. יתר על כן, שלטים מורפולוגית ברורים Aβ, כגון הליבה, neuritic, לפזר, ונשרף-out שלטים ניתן לתייג על ידי נוכחי ביעילות יותר מאשר עם כל אחד האחרים מאגד עמילואיד בעלי צבע7. בסך הכל, הנוכחי יכול להיות מוחל על תווית ותמונה Aβ פלאק ברקמת המוח לאחר המוות של AD מודלים בעלי חיים ו/או רקמת AD האדם בצורה קלה וזולה, כחלופה אמינה לנוגדנים ספציפיים Aβ.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההשערה שלנו הייתה כי הנוכחי יכול לשמש כדרך המהירה, הקלה ביותר, והזולה ביותר לתווית ותמונה Aβ פלאק ברקמת המוח הנתיחה לאחר המוות בהשוואה לצבעים אחרים של האיגוד עמילואיד, כמו גם נוגדנים ספציפיים Aβ. מטרות מחקר זה היו כדי לקבוע את הזמן המינימלי הנדרש תווית ותמונה לוחיות Aβ ידי Cur בנתיחה לאחר המו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
התמיכה עבור מחקר זה הגיע מן המכון למדעי השדה בהתעלות של מריה הקדושה.
Materials
| 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | IHC world, Woodstock, MD | ||
| Aanimal model of Alzheimer's disease | Jackson's laboratory, Bar Harbor, ME | ||
| Absolute alcohol | VWR,Radnor, PA | ||
| Alexa 594 | Santacruz Biotech, Dallas, TX | ||
| Antibody 6E10 | Biolegend, San Diego, CA | ||
| Antibody A11 | Millipore, Burlington, MA | ||
| Compound light microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus BX51 | |
| Congo red | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Cryostat | GMI, Ramsey, MN | LeicaCM1800 | |
| Curcumin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Disodium hydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Dystyrene plasticizer xylene | BDH, Dawsonville, GA | ||
| Filter papers | Fisher scientific, Pittsburgh, PA | ||
| Hoechst-33342 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Inverted fluorescent microscope | Leica, Buffalo Grove, IL | Leica DMI 6000B | |
| Inverted fluorescent microscope | Olympus, Shinjuku, Japan | Olympus 1×70 | |
| Normal goat serum | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraffin | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Paraformaldehyde | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Ploy-lysine coated charged glass slide | Globe Scientific Inc, Mahwah, NJ | ||
| Potassium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Potassium dihydrogen phosphate | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium azide | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium chloride | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Sodium hydroxide | EMD Millipore, Burlington, MA | ||
| Sodium pentobarbital | Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI | ||
| Thioflavin-S | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Triton-X-100 | Sigma, St. Louis, MO | ||
| Xylene | VWR,Radnor, PA |
References
- Cummings, J. L. Alzheimer’s disease. New England Journal of Medicine. 351 (1), 56-67 (2004).
- Jack, C. R., Holtzman, D. M. Biomarker modeling of Alzheimer’s disease. Neuron. 80 (6), 1347-1358 (2013).
- Tarawneh, R., Holtzman, D. M. The clinical problem of symptomatic Alzheimer disease and mild cognitive impairment. Cold Spring Harbor Perspectives in Medicine. 2 (5), (2012).
- Selkoe, D. J. Cell biology of protein misfolding: the examples of Alzheimer’s and Parkinson’s diseases. Nature Cell Biology. 6 (11), 1054-1061 (2004).
- Hardy, J., Allsop, D. Amyloid deposition as the central event in the aetiology of Alzheimer’s disease. Trends in Pharmacological Sciences. 12 (10), 383-388 (1991).
- Chen, M., et al. Use of curcumin in diagnosis, prevention, and treatment of Alzheimer’s disease. Neural Regeneration Research. 13 (4), 742-752 (2018).
- Maiti, P., et al. A comparative study of dietary curcumin, nanocurcumin, and other classical amyloid-binding dyes for labeling and imaging of amyloid plaques in brain tissue of 5x-familial Alzheimer’s disease mice. Histochemistry and Cell Biology. 146 (5), 609-625 (2016).
- Maiti, P., Dunbar, G. L. Use of Curcumin, a Natural Polyphenol for Targeting Molecular Pathways in Treating Age-Related Neurodegenerative Diseases. International Journal of Molecular Sciences. 19 (6), (2017).
- Maiti, P., Dunbar, G. L. Comparative Neuroprotective Effects of Dietary Curcumin and Solid Lipid Curcumin Particles in Cultured Mouse Neuroblastoma Cells after Exposure to Abeta42. International Journal of Alzheimer’s Disease. , (2017).
- den Haan, J., Morrema, T. H. J., Rozemuller, A. J., Bouwman, F. H., Hoozemans, J. J. M. Different curcumin forms selectively bind fibrillar amyloid beta in post mortem Alzheimer’s disease brains: Implications for in-vivo diagnostics. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 75 (2018).
- Koronyo, Y., et al. Retinal amyloid pathology and proof-of-concept imaging trial in Alzheimer’s disease. JCI Insight. 2 (16), (2017).
- Koronyo, Y., Salumbides, B. C., Black, K. L., Koronyo-Hamaoui, M. Alzheimer’s disease in the retina: imaging retinal abeta plaques for early diagnosis and therapy assessment. Neurodegenerative Diseases. 10 (1-4), 285-293 (2012).
- Koronyo-Hamaoui, M., et al. Identification of amyloid plaques in retinas from Alzheimer’s patients and noninvasive in vivo optical imaging of retinal plaques in a mouse model. NeuroImage. 54 (Suppl 1), S204-S217 (2011).
- Ran, C., et al. Design, synthesis, and testing of difluoroboron-derivatized curcumins as near-infrared probes for in vivo detection of amyloid-beta deposits. Journal of the American Chemical Society. 131 (42), 15257-15261 (2009).
- Beach, T. G. The Sun Health Research Institute Brain Donation Program: Description and Experience, 1987-2007. Cell Tissue Bank. 9 (3), 229-245 (2008).
- Green, S. J., Killiany, R. J. Subregions of the inferior parietal lobule are affected in the progression to AD. Neurobiology of Aging. 31 (8), 1304-1311 (2010).
- Ono, K., Hasegawa, K., Naiki, H., Yamada, M. Curcumin has potent anti-amyloidogenic effects for Alzheimer’s beta-amyloid fibrils in vitro. Journal of Neuroscience Research. 75 (6), 742-750 (2004).
- Garcia-Alloza, M., Borrelli, L. A., Rozkalne, A., Hyman, B. T., Bacskai, B. J. Curcumin labels amyloid pathology in vivo, disrupts existing plaques, and partially restores distorted neurites in an Alzheimer mouse model. Journal of Neurochemistry. 102 (4), 1095-1104 (2007).
- Mutsuga, M., et al. Binding of curcumin to senile plaques and cerebral amyloid angiopathy in the aged brain of various animals and to neurofibrillary tangles in Alzheimer’s brain. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (1), 51-57 (2012).
- Tei, M., Uchida, K., Mutsuga, M., Chambers, J. K., Nakayama, H. The binding of curcumin to various types of canine amyloid proteins. Journal of Veterinary Medical Science. 74 (4), 481-483 (2012).
- Liu, L., Komatsu, H., Murray, I. V., Axelsen, P. H. Promotion of amyloid beta protein misfolding and fibrillogenesis by a lipid oxidation product. Journal of Molecular Biology. 377 (4), 1236-1250 (2008).
- Wu, C., Scott, J., Shea, J. E. Binding of Congo red to amyloid protofibrils of the Alzheimer Abeta(9-40) peptide probed by molecular dynamics simulations. Biophysical Journal. 103 (3), 550-557 (2012).
- Wu, C., Wang, Z., Lei, H., Zhang, W., Duan, Y. Dual binding modes of Congo red to amyloid protofibril surface observed in molecular dynamics simulations. Journal of the American Chemical Society. 129 (5), 1225-1232 (2007).
- Gutierrez, I. L., et al. Alternative Method to Detect Neuronal Degeneration and Amyloid beta Accumulation in Free-Floating Brain Sections With Fluoro-Jade. ASN Neuro Methods. 10, 1-7 (2018).
- Yang, F., et al. Curcumin inhibits formation of amyloid beta oligomers and fibrils, binds plaques, and reduces amyloid in vivo. Journal of Biological Chemistry. 280 (7), 5892-5901 (2005).
