Producción de Conjuntos de Motores de Dynein y Kinesin en Nanoestructuras de Origami de ADN para Observación de MoléculaS Simples

La dinneina y la quinesina son proteínas motoras citoesqueléticas responsables de innumerables funciones en las células eucariotas¹. Al convertir la energía química de la hidrólisis ATP en trabajo productivo, estos motores se translocan en microtúbulos para transportar y distribuir diversas cargas intracelulares. También se coordinan en los reordenamientos intracelulares masivos asociados con la mitosis, donde exhiben fuerzas orquestadas que contribuyen al posicionamiento y separación de los cromosomas. Ensayos estructurales, bioquímicos y biofísicos, incluidas observaciones de moléculas únicas, han revelado los mecanismos de estos motores a nivel individual (bien revisados en trabajos anteriores^2,3,4). Sin embargo, muchas de las tareas de los motores requieren que trabajen en pequeños conjuntos de tipos de motores similares y mixtos. Comparativamente menos se entiende sobre los mecanismos que coordinan la actividad y la última motilidad emergente de estos conjuntos^5,6. Esta brecha de conocimiento se debe, en parte, a la dificultad de crear conjuntos con características controlables, como el tipo de motor y el número de copia. Durante la última década, se han empleado las técnicas de construcción molecular del origami de ADN para resolver este problema. Para los motores basados en microtúbulos, algunos ejemplos de estas investigaciones incluyen observaciones de molécula única de conjuntos de dinneina citoplásmica-1^7,8,9, dinneina intraflagelar¹¹, varios motores de kinesina^12,13, y mezclas de dineinas y kinesinas^7,14,15. Aquí, proporcionamos detalles de la purificación y etiquetado de oligonucleótidos de motores de levadura^{7,16,17,18,20,} plegado y purificación de origami de ADN segmentado con conformidad ajustable⁸, y la toma de imágenes de los motores de levadura propulsando las estructuras del chasis^7,18.

La construcción de conjuntos motores para la observación in vitro de molécula única requiere tres esfuerzos primarios. La primera es la expresión, purificación y etiquetado de construcciones motoras adecuadas para adherirse al origami de ADN. La segunda es la producción y purificación de estructuras de origami de ADN definidas (a menudo denominadas “chasis”). Y la tercera es la conjugación de los motores a la estructura del chasis seguida de la observación utilizando la microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF). Aquí, proporcionamos protocolos establecidos para este proceso para motores recombinantes a base de microtúbulos purificados de la levadura Saccharomyces cerevisiae^7,16,17,^{18, 19}. Se han investigado conjuntos motores a base de origami de ADN utilizando kinesina recombinante¹⁵ y dinaína^7,8,18 construcciones producidas en este sistema de expresión de levadura^{16 ,17,18,19}. Este protocolo es válido para estas construcciones, dado que están controladas por el promotor inducido por galactosa, y fusionadas a las mismas etiquetas proteicas para la purificación (vinculador de proteasa ZZ y TEV) y para la oligoconjugación de ADN (SNAPtag).

Las cepas de levadura específicas producen construcciones motoras específicas. Por ejemplo, la dinneina utilizada para estudiar el papel del cumplimiento de la carga se purificó a partir de la cepa RPY1084^7,8. En general, se pueden solicitar cepas que contengan construcciones motoras con las modificaciones genéticas apropiadas para la expresión y la purificación a los laboratorios que han publicado el uso de dichos motores. Las construcciones con atributos novedosos como mutaciones o etiquetas se pueden hacer utilizando técnicas genéticas recombinantes, como la transformación de acetato de litio²¹ y kits comerciales. Se han publicado protocolos detallados para la creación de proteínas motoras modificadas en levaduras para estudios de molécula única¹⁹. Además de los motores que se fusionan con el SNAPtag, los oligos utilizados para etiquetar los motores deben conjugarse con el sustrato SNAP, la bencileguanina (BG); Los protocolos publicados anteriormente describen la formación y purificación de BG-oligo conjugados¹⁸. La estrategia general descrita aquí también se ha empleado para motores basados en actina (véanse los trabajos anteriores, por ejemplo,^22,23,24), y los motores purificados de otros organismos y sistemas de expresión (véase funciona por ejemplo^{7,9,10,11,12,13,14}).

Los microtúbulos polimerizados (MT) se utilizan en estos experimentos en dos procedimientos diferentes. La purificación de afinidad MT de motores funcionales requiere MT que no estén etiquetados con otros grupos funcionales, mientras que el ensayo TIRF de motilidad de conjunto motor requiere MTs etiquetados con biotina y fluoróforos. En todos los casos, los MT se estabilizan con taxol para evitar la desnaturalización. El paso de purificación de afinidad MT se utiliza para eliminar cualquier motor no móvil con una alta afinidad MT, ya que estos motores pueden alterar la motilidad del conjunto si se conjugan a un chasis. Durante este proceso, los motores activos desuntan los MT y permanecen en solución, mientras que los motores de unión ajustada giran hacia abajo en el pellet MT. Esto ayuda a garantizar que todos los motores del chasis sean de una población activa.

Se ha utilizado una variedad de estructuras de origami de ADN para estudiar conjuntos motores citoesqueléticos. A medida que la comprensión mecanicista del transporte de conjuntos ha aumentado, las estructuras de origami de ADN empleadas en experimentos han crecido en complejidad. En principio, cualquier estructura podría adaptarse para este fin siempre que se modifique para incluir sitios de unión de ADN de una sola cadena para motores y fluoróforos. Los diseños y atributos específicos del chasis pueden ser útiles para sondear preguntas particulares sobre el comportamiento emergente de los conjuntos de motores. Por ejemplo, se han utilizado varillas rígidas para desarrollar conocimientos fundamentales de cómo el número de copia afecta al transporte por equipos de dininyins y kinesins^7,15,18y 2D plataformas se han utilizado para estudiar el conjunto de miosina se han utilizado para estudiar conjunto de miosina se han utilizado para estudiar conjunto de miosina navegación de las redes actin²². Se han utilizado estructuras con flexibilidad variable o ajustable para comprender las funciones del acoplamiento elástico entre motores y para sondear cómo la sincronización escalonada afecta a la motilidad^8,24. Más recientemente, las estructuras esféricas se utilizan para obtener información sobre cómo las restricciones geométricas a la unión de vías motoras afectan a la dinámica de la motilidad^25.

En este protocolo, ofrecemos pasos específicos para experimentos de conjunto en chasis segmentados con rigidez variable. Los sitios de enlace en el chasis a veces se conocen como “manijas”, mientras que las secuencias de ADN complementarias que unen estas asas se denominan “antimanijas”. El número de motores en estos chasis está determinado por el cual los segmentos contienen grapas de mango extendidas con complementariedad con el oligo handle en los motores oligoetiquetados. El uso de diferentes secuencias de mango en diferentes segmentos permite la unión de diferentes tipos de motores a ubicaciones específicas en el chasis. El chasis detallado aquí se compone de 7 segmentos rígidos secuenciales, cada uno compuesto por 12 hélices de ADN de doble cadena dispuestas en 2 anillos concéntricos^8. Los segmentos rígidos contienen las manijas del motor y están conectados a través de regiones que pueden ser ADN flexible de una sola cadena o ADN rígido de doble cadena, dependiendo de la ausencia o presencia, respectivamente, de grapas “linker”. Por lo tanto, el cumplimiento de la estructura del chasis viene determinado por la presencia o ausencia de estas grapas “linker”. Véanse los informes anteriores para obtener más detalles y secuencias de ADN específicas⁸. Además, se pueden utilizar varios métodos para purificar el chasis^26. El método de centrifugación de gradiente de glicerol zonal de velocidad²⁷ se describe aquí.