Производство динамовских и кинезинских моторных ансамблей на наноструктурах ДНК оригами для наблюдения за одной молекулой

Динейн и кинезин являются цитоскелетные моторные белки, ответственные за множество функций в эукариотических клетках¹. Преобразовывая химическую энергию гидролизов АТФ в производительную работу, эти двигатели перемещают на микротрубах для перевозки и распределения различных внутриклеточных грузов. Они также координируют свои действия в массовых внутриклеточных перестановках, связанных с митозом, где они проявляют организованные силы, способствующие распозиции и разделению хромосом. Структурные, биохимические и биофизические анализы, включая наблюдения за одной молекулой, выявили механизмы этих двигателей на индивидуальном уровне (хорошо рассмотрены в предыдущих работах^2,3,4). Тем не менее, многие из задач двигателей требуют, чтобы они работали в небольших ансамблях как аналогичных, так и смешанных типов двигателей. Сравнительно меньше понимается о механизмах, которые координируют деятельность и конечную возникающие подвижность этих ансамблей^5,6. Этот разрыв в знаниях отчасти объясняется трудностями в создании ансамблей с управляемыми функциями, такими как тип двигателя и номер копии. За последнее десятилетие для решения этой проблемы использовались методы молекулярной конструкции ДНК-оригами. Для микротрубочек на основе двигателей, некоторые примеры этих исследований включают в себя одной молекулы наблюдений ансамблей цитоплазматического динейна-1^7,8,9, интрафлагеллар dynein¹¹, различные кинезинные двигатели^12,13,и смеси как диньинов, так и кинезинов^7,14,15. Здесь мы предоставляем подробную информацию об очистке и олигонуклеотидной маркировке двигателей из дрожжей^{7,16,17,18,19,20}, складывание и очистка сегментированных ДНК оригами с tunable соответствия⁸, и изображения дрожжевых двигателей, движущих конструкций шасси^7,18.

Построение моторных ансамблей для наблюдения одной молекулы in vitro требует трех основных усилий. Во-первых, это экспрессия, очистка и маркировка конструкций двигателя, пригодных для присоединения к ДНК оригами. Во-вторых, производство и очистка определенных структур ДНК оригами (часто называют “шасси”). И третье – спряжение двигателей к конструкции шасси с последующей наблюдением с использованием общей внутренней отражения флуоресценции (TIRF) микроскопии. Здесь мы предоставляем установленные протоколы для этого процесса для рекомбинантных микротрубоукладных двигателей, очищенных от дрожжей Saccharomyces cerevisiae^{7,16,17,18, 19}. ДНК оригами основе моторных ансамблей были исследованы с использованием рекомбинантных кинезин¹⁵ и dynein^7,8,18 конструкций, произведенных в этой системе выражения дрожжей^{16 ,17,18,19}. Этот протокол действителен для этих конструкций, учитывая, что они контролируются галактозой индуцированного промоутера, и сливается с теми же теги белка для очистки (я и TEV протеазы связующее) и для спряжения олиго ДНК (SNAPtag).

Специфические штаммы дрожжей производят специфические конструкции двигателя. Например, динейн, используемый для изучения роли соответствия груза, очищался от штамма RPY1084^7,8. В целом, штаммы, содержащие моторные конструкции с соответствующими генетическими модификациями для выражения и очистки, могут быть запрошены у лабораторий, опубликовав использование этих двигателей. Конструкции с новыми атрибутами, такими как мутации или теги, могут быть сделаны с использованием рекомбинантных генетических методов, таких как преобразование литий-ацетата²¹ и коммерческие наборы. Подробные протоколы для создания модифицированных моторных белков в дрожжах для одного исследования молекулы были опубликованы¹⁹. В дополнение к двигателям, слитым в СНАПтаг, олиго, используемые для маркировки двигателей, должны быть спряжены с субстратом SNAP, бензилгуанином (БГ); ранее опубликованные протоколы описывают формирование и очищение BG-oligo конъюгирует¹⁸. Общая стратегия, описанная здесь, также используется для двигателей на основе actin (см. предыдущие работы для примеров^22,23,24),и двигателей, очищенных от других организмов и систем выражения (см. предыдущий работает для примеров^{7,9,10,11,12,13,14}).

Полимеризованные микротрубочки (МТ) используются в этих экспериментах в двух различных процедурах. MT сродство очистки функциональных двигателей требует MTs, которые не помечены с другими функциональными группами, в то время как двигательно-ансамбльподвижность TIRF ассс требует MTs помечены биотин и фторофоры. Во всех случаях, MTs стабилизируются с таксолом для предотвращения денатурации. Шаг очистки сродства MT используется для удаления любых не-мотиловых двигателей с высоким сродством МТ, так как эти двигатели могут изменить подвижность ансамбля, если они спрягиваются к шасси. Во время этого процесса активные двигатели отвязывают МТ и остаются в растворе, в то время как плотные связывающие двигатели вращаются в гранулах Mt. Это помогает гарантировать, что все двигатели на шасси от активной популяции.

Разнообразие структур ДНК оригами были использованы для изучения цитоскелетных двигательных ансамблей. По мере того как механистическое понимание ансамблевого транспорта росло, структуры ДНК оригами, используемые в экспериментах, росли в сложности. В принципе, любая структура может быть адаптирована для этой цели при условии, что она будет изменена, чтобы включить одноцепочечные участки вложения ДНК для двигателей и фторфоров. Конкретные конструкции шасси и атрибуты могут быть полезны для зондирования конкретных вопросов о возникающих поведение двигателей ансамблей. Например, жесткие стержни были использованы для разработки основополагающих знаний о том, как номер копий влияет на транспортировку командами динейнов и кинезинов^7,15,18,и 2D платформы были использованы для изучения миозина ансамбля навигация актинских сетей²². Структуры с переменной или настраиваемой гибкостью были использованы для понимания роли эластичного соединения между двигателями и для зондирования того, как синхронизация шага влияет на подвижность^8,24. В последнее время сферические структуры используются для получения информации о том, как геометрические ограничения на привязку двигателя влияют на динамику подвижности^25.

В этом протоколе мы предлагаем конкретные шаги для ансамблевых экспериментов на сегментированном шасси с переменной жесткостью. Связывание сайтов на шасси иногда называют “ручками”, в то время как дополнительные последовательности ДНК, которые связывают эти ручки, называются “антиручками”. Количество двигателей на этих шасси определяется тем, какие сегменты содержат расширенные скобы рукоятки с дополнением к антихендному олиго на олиго-маркированных двигателях. Использование различных последовательностей рукояток на разных сегментах позволяет привязывать различные типы двигателей к определенным местам на шасси. Подробное здесь шасси состоит из 7 последовательных жестких сегментов, каждый из которых состоит из 12 двухцепочечных сипов ДНК, расположенных в 2 концентрических^{кольцах 8.} Строгие сегменты содержат моторные ручки и соединены через области, которые могут быть либо гибкой одноцепочечной ДНК или жесткой двухцепочечной ДНК, в зависимости от отсутствия или присутствия, соответственно, “связующих” скобы. Соответствие конструкции шасси, таким образом, определяется наличием или отсутствием этих “связных” скобок. Смотрите предыдущие отчеты для получения более подробной информации и конкретных последовательностей ДНК⁸. Кроме того, несколько методов могут быть использованы для очистки шасси²⁶. Здесь описан метод центрифугации градиции тарифного зонального глицерола^27.