Produção de conjuntos de motor de dynein e de Kinesin em nanostructures do ADN origami para a única observação da molécula

A dynein e a cinesina são proteínas do motor citoesquelético responsáveis por inúmeras funções em células eucarióticas¹. Convertendo a energia química da hidrólise de ATP em trabalho produtivo, estes motores translocam em microtúbulos para transportar e distribuir várias cargas intracelulares. Eles também coordenam os rearranjos intracelulares maciços associados à mitose, onde exibem forças orquestradas que contribuem para o posicionamento e separação dos cromossomas. Ensaios estruturais, bioquímicos e biofísicos, incluindo observações de moléculas únicas, revelaram os mecanismos desses motores no nível individual (bem revisado em trabalhos anteriores^2,3,4). No entanto, muitas das tarefas dos motores exigem que trabalhem em pequenos conjuntos de tipos de motor semelhantes e mistos. Comparativamente menos é compreendido sobre os mecanismos que coordenam a atividade e a motilidade emergente final destes conjuntos^5,6. Essa lacuna de conhecimento é devida, em parte, à dificuldade em criar conjuntos com características controláveis, como tipo de motor e número de cópia. Durante a última década, as técnicas de construção molecular de DNA origami têm sido empregadas para resolver este problema. Para os motores baseados em microtúlulas, alguns exemplos dessas investigações incluem a única molécula de observações de conjuntos de dynein citoplasmático-1^7,8,9, dynein intraflagellar¹¹, vários motores de cinesina^12,13, e misturas de ambos os dyneins e kinesins^7,14,15. Aqui, nós fornecemos detalhes da purificação e oligonucleotide rotulagem de motores de levedura^{7,16,17,18,19,20}, o dobradura e purificação de origami de DNA segmentada com conformidade sintonável⁸, e a imagem dos motores de levedura impulsionando as estruturas do chassi^7,18.

Construir conjuntos de motor para a observação in vitro da molécula única exige três esforços preliminares. O primeiro é a expressão, purificação e rotulagem de construções motoras adequadas para anexar ao DNA origami. O segundo é a produção e purificação de estruturas de origami DNA definido (muitas vezes denominado “chassis”). E a terceira é a conjugação dos motores à estrutura do chassi seguida da observação usando a microscopia interna total da fluorescência da reflexão (TIRF). Aqui, nós fornecemos protocolos estabelecidos para este processo para os motores microtubule-baseados de recombinação purificados do fermento Saccharomyces cerevisiae^{7,16,17,18, 19}. os conjuntos de motor baseados em Origami de DNA foram investigados usando ambos os cinesina recombinante¹⁵ e dynein^7,8,18 construções produzidas neste sistema de expressão de levedura^{16 ,17,18,19}. Este protocolo é válido para estas construções, dado que são controlados pelo promotor induzido galactose, e fundidos aos mesmos Tag da proteína para a purificação (linker do protease de ZZ e de TEV) e para a conjugação do oligo do ADN (SNAPtag).

Cepas específicas de levedura produzem construções motoras específicas. Por exemplo, o dynein usado para estudar o papel da conformidade da carga foi purified da tensão RPY1084^7,8. Em geral, as cepas contendo construções motoras com as modificações genéticas apropriadas para expressão e purificação podem ser solicitadas a partir dos laboratórios que publicaram o uso desses motores. Construções com novos atributos como mutações ou Tags podem ser feitas usando técnicas genéticas recombinantes, como a transformação de acetato de lítio²¹ e kits comerciais. Os protocolos detalhados para criar proteínas de motor modificadas no fermento para estudos da única molécula foram publicados¹⁹. Além dos motores que estão sendo fundidos ao SNAPtag, os oligos usados para rotular os motores devem ser conjugados ao substrato SNAP, a benzilguanina (BG); os protocolos previamente publicados descrevem a formação e a purificação de conjugados de BG-oligo¹⁸. A estratégia global descrita aqui também foi empregada para motores baseados em Actin (ver trabalhos anteriores para exemplos^22,23,24), e motores purificados de outros organismos e sistemas de expressão (ver anterior trabalhos para exemplos^{7,9,10,11,12,13,14}).

Microtúbulos polimerizados (MTs) são utilizados nestes experimentos em dois procedimentos diferentes. A purificação da afinidade do MT de motores funcionais exige o MTs que não são etiquetados com outros grupos funcionais, quando o ensaio do TIRF da motilidade do motor-Ensemble exigir o MTs etiquetado com a biotina e os Fluorophores. Em todos os casos, os MTs são estabilizados com Taxol para evitar a desnaturação. A etapa da purificação da afinidade do MT é usada para remover todos os motores não-motile com uma afinidade elevada do MT, porque estes motores podem alterar a motilidade do conjunto se conjugados a um chassi. Durante este processo, os motores activos desligam os MTs e permanecem em solução, enquanto os motores de ligação apertada giram para baixo no pellet MT. Isso ajuda a garantir que todos os motores do chassi sejam de uma população ativa.

Uma variedade de estruturas do origami do ADN foi usada para estudar conjuntos do motor do cytoesquelético. Como a compreensão mecanicista do transporte de Ensemble aumentou, as estruturas de DNA origami empregadas em experimentos têm crescido em complexidade. Em princípio, qualquer estrutura poderia ser adaptada para este fim, desde que seja modificada para incluir sítios de fixação de ADN de ligação única para motores e fluoróforos. Os projetos e os atributos específicos do chassi podem ser úteis para sondar perguntas particulares sobre o comportamento emergente de conjuntos dos motores. Por exemplo, hastes rígidas têm sido usadas para desenvolver o conhecimento fundamental de como o número de cópias afeta o transporte por equipes de dyneins e kinesins^7,15,18e 2D plataformas têm sido usadas para estudar miosina Ensemble navegação das redes actina²². As estruturas com flexibilidade variável ou sintonizável foram usadas para compreender as funções do acoplamento elástico entre motores e para sondar como a sincronização de piso afeta a motilidade^8,24. Mais recentemente, as estruturas esféricas estão sendo usadas para obter a introspecção em como as limitações geométricas à ligação da motor-trilha afetam a dinâmica da motilidade²⁵.

Neste protocolo, nós oferecemos etapas específicas para experiências do conjunto no chassi segmentado com rigidez variável. Os locais de ligação no chassi são chamados às vezes como “punhos”, quando as seqüências complementares do ADN que ligam estes punhos forem denominadas “antihandles”. O número de motores nestes chassis é determinado pelo qual os segmentos contêm grampos extendidos do punho com complementaridade ao oligo do antihandle nos motores oligo-etiquetados. O uso de diferentes sequências de alça em diferentes segmentos permite a vinculação de diferentes tipos de motores a locais específicos no chassi. O chassi detalhado aqui é compor de 7 segmentos rígidos sequenciais, cada um compreendido de 12 hélices dobro-encalhado do ADN arranjados em 2 anéis concêntricos⁸. Os segmentos rígidos contêm os punhos do motor e são conectados através das regiões que podem ser o ADN único-encalhado flexível ou o ADN dobro-encalhado rígido, dependendo da ausência ou da presença, respectivamente, de grampos do “linker”. A conformidade da estrutura do chassi é determinada assim pela presença ou pela ausência destes grampos do “linker”. Veja os relatórios precedentes para mais detalhes e seqüências específicas⁸do ADN. Além disso, vários métodos podem ser usados para purificar o chassi²⁶. O método de centrifugação de gradiente de glicerol taxa-zonal²⁷ é descrito aqui.