Produzione di Dynein e Kinesin Motor Ensemble su nanostrutture DNA Origami per l'osservazione a singola molecola

La dineina e la cinesia sono proteine motorie citoscheletriche responsabili di una miriade di funzioni nelle cellule eucariotiche¹. Convertendo l’energia chimica dell’idrolisi ATP in lavoro produttivo, questi motori traslocano sui microtubuli per trasportare e distribuire vari carichi intracellulari. Si coordinano anche nei massicci riarrangiamenti intracellulari associati alla mitosi, dove esibiscono forze orchestrate che contribuiscono al posizionamento e alla separazione dei cromosomi. I saggi strutturali, biochimici e biofisici, comprese le osservazioni su singola molecola, hanno rivelato i meccanismi di questi motori a livello individuale (ben esaminati nei lavori precedenti^2,3,4). Tuttavia, molti dei compiti dei motori richiedono loro di lavorare in piccoli gruppi di motori simili e misti. Comparativamente meno si intende i meccanismi che coordinano l’attività e la motilità emergente finale di questi insiemi^5,6. Questa lacuna di conoscenze è dovuta, in parte, alla difficoltà di creare insiemi con caratteristiche controllabili, come il tipo di motore e il numero di copia. Nell’ultimo decennio, le tecniche di costruzione molecolare degli origami di DNA sono state impiegate per risolvere questo problema. Per i motori basati su microtubuli, alcuni esempi di queste indagini includono osservazioni a singola molecola di insiemi di dineeina citoplasmica-1^7,8,9, dineina intraflagellare¹¹, vari motori kinesin^12,13, e miscele di dine e kinesins^7,14,15. Qui, forniamo dettagli sulla purificazione e l’etichettatura oligonucleotide dei motori da lievito^{7,16,17,18,19,20}, il piegamento e purificazione degli origami di DNA segmentato con conformità regolabile⁸e l’imaging dei motori di lievito che prospettano le strutture del telaio^7,18.

Costruire insiemi motori per l’osservazione in vitro a singola molecola richiede tre sforzi primari. Il primo è l’espressione, la purificazione e l’etichettatura dei costrutti motori adatti per l’attaccamento agli origami di DNA. Il secondo è la produzione e la purificazione di strutture definite di origami di DNA (spesso chiamato “telaio”). E la terza è la coniugazione dei motori alla struttura del telaio seguita dall’osservazione utilizzando la microscopia a fluorescenza totale della riflessione interna (TIRF). Qui, forniamo protocolli stabiliti per questo processo per motori ricombinanti a base di microtubuli purificati dal lievito Saccharomyces cerevisiae^{7,16,17,18, 19}. Sono stati studiati insiemi motori basati su origami di DNA utilizzando sia kinesin ariente¹⁵ che dynein^7,8,18 costrutti prodotti in questo sistema di espressione del lievito^{16 ,17,18,19}. Questo protocollo è valido per questi costrutti, dato che sono controllati dal promotore indotto da galactose, e fusi agli stessi tag proteici per la purificazione (linker proteasete TEV) e per la coniugazione dell’oligo del DNA (SNAPtag).

Ceppi di lievito specifici producono costrutti motori specifici. Ad esempio, la dineina utilizzata per studiare il ruolo della conformità del carico è stata purificata dal ceppo RPY1084^7,8. In generale, i ceppi contenenti costrutti motori con le opportune modifiche genetiche per l’espressione e la purificazione possono essere richiesti ai laboratori dopo aver pubblicato l’uso di tali motori. I costrutti con nuovi attributi come mutazioni o tag possono essere realizzati utilizzando tecniche genetiche ricombinanti, come la trasformazione acetato di litio²¹ e i kit commerciali. Sono stati pubblicati protocolli dettagliati per la creazione di proteine motorie modificate nel lievito per studi su singole molecole¹⁹. Oltre ai motori fusi al SNAPtag, le oligo utilizzate per etichettare i motori devono essere coniugate al substrato SNAP, benzylguanine (BG); Protocolli pubblicati in precedenza descrivono la formazione e la purificazione dei coniugi BG-oligo¹⁸. La strategia globale qui descritta è stata impiegata anche per motori basati su actin (vedi lavori precedenti per gli esempi^22,23,24) e motori purificati da altri organismi e sistemi di espressione (vedi precedenti funziona per gli esempi^{7,9,10,11,12,13,14}).

I microtubuli polimerizzati (MT) vengono utilizzati in questi esperimenti in due diverse procedure. La purificazione dell’affinità MT dei motori funzionali richiede MT che non sono etichettati con altri gruppi funzionali, mentre l’analisi motilità motor-ensemble TIRF richiede MT etichettati con biotina e fluorofori. In tutti i casi, le MT sono stabilizzate con taxol per prevenire la denaturazione. Il passaggio di purificazione dell’affinità MT viene utilizzato per rimuovere tutti i motori non motile con un’elevata affinità MT, in quanto questi motori possono alterare la motilità dell’insieme se coniugati a un telaio. Durante questo processo, i motori attivi dislegano le MT e rimangono in soluzione, mentre i motori a legame stretto girano verso il basso nel pellet MT. Questo aiuta a garantire che tutti i motori sul telaio provengono da una popolazione attiva.

Una varietà di strutture di origami di DNA sono stati utilizzati per studiare gli insiemi motori citoscheletrici. Con l’aumentare della comprensione meccanicistica del trasporto di insiemi, le strutture di origami del DNA impiegate negli esperimenti sono cresciute in complessità. In linea di principio, qualsiasi struttura potrebbe essere adattata a questo scopo a condizione che venga modificata per includere siti di fissaggio del DNA a filamento singolo per motori e fluorofori. Specifici progetti e attributi del telaio possono essere utili per sondare particolari domande sul comportamento emergente dei motori incui. Ad esempio, le aste rigide sono state utilizzate per sviluppare una conoscenza fondamentale di come il numero di copie influenzi il trasporto da parte di squadre di dine e kinesins^7,15,18e piattaforme 2D sono state utilizzate per studiare l’ensemble di miosina navigazione delle reti actin²². Strutture con flessibilità variabile o regolabile sono state utilizzate per comprendere i ruoli di accoppiamento elastico tra motori e per sondare come la sincronizzazione passo influisce sulla sincronizzazione influisce sulla motilità^8,24. Più recentemente, le strutture sferiche vengono utilizzate per ottenere informazioni su come i vincoli geometrici alla rilegatura del motore influenzano la dinamica della motilità²⁵.

In questo protocollo, offriamo passaggi specifici per esperimenti di ensemble su telai segmentati con rigidità variabile. I siti di legame sullo chassis sono a volte indicati come “maniglie”, mentre le sequenze di DNA complementari che legano queste maniglie sono chiamate “antihandle”. Il numero di motori su questi telai è determinato da quali segmenti contengono punti metallici estesi con complementarità all’oligo antihandle sui motori con etichetta oligo. L’utilizzo di sequenze di maniglie diverse su segmenti diversi consente di associare diversi tipi di motori a posizioni specifiche sullo chassis. Il telaio qui dettagliato è composto da 7 segmenti rigidi sequenziali, ciascuno composto da 12 eliche di DNA a doppio filamento disposte in 2 anelli concentrici⁸. I segmenti rigidi contengono le maniglie del motore e sono collegati attraverso regioni che possono essere sia DNA a filamento singolo flessibile o DNA a doppio filamento rigido, a seconda dell’assenza o della presenza, rispettivamente, di graffette “linker”. La conformità della struttura del telaio è quindi determinata dalla presenza o dall’assenza di questi elementi di base “linker”. Vedere i rapporti precedenti per ulteriori dettagli e specifiche sequenze di DNA⁸. Inoltre, è possibile utilizzare più metodi per purificare lo chassis²⁶. Il metodo di centrifugazione del gradiente di glicerolo di tasso-zonale²⁷ è descritto qui.