ייצור Dynein וקינסין הרכבים מוטוריים ב-DNA אוריגמי ננו מבנים עבור תצפית מולקולה אחת

Dynein ו קינזין הם השלד מוטוריים חלבונים האחראים פונקציות רבות בתאים איקריוטית¹. על ידי המרת האנרגיה הכימית של ATP הידרוליזה לתוך עבודה יצרנית, מנועים אלה לאתר על microtubules לגרור ולהפיץ cargos שונים תאיים. הם גם מתאמים הסדרים תאיים מסיבי הקשורים mitosis, שם הם מציגים כוחות מתוזמר שתורמים מיקום והפרדה של כרומוזומים. מבנית, ביוכימית ובביופיסית assays כולל תצפיות במולקולה אחת, חשפו את המנגנונים של מנועים אלה ברמה האינדיבידואלית (שנסקרו היטב בעבודות קודמות^2,3,4). עם זאת, רבים מהמשימות של מנועים דורשים מהם לעבוד בהרכבים קטנים של סוגי מנוע דומים ומעורבים. יחסית פחות מובן על המנגנונים המתאמים את הפעילות והתנועתיות האולטימטיבית של ההרכבים האלה^5,6. פער ידע זה נובע, בין השאר, לקושי ביצירת הרכבים בעלי תכונות שלשליטה, כגון סוג מנוע ומספר עותק. במהלך העשור האחרון, טכניקות הבנייה המולקולרית של אוריגמי DNA כבר מועסקים כדי לפתור את הבעיה. עבור מנועי המיקרו-כדורית, מספר דוגמאות של חקירות אלה כוללות תצפיות בודדות של מולקולה של הרכבים של cytoplasmic דינאין-1^7,8,9, בתוך הבית דינאין בשנת¹¹, מנועי השונים מוטורס 12^,13, ותערובות של דיינונים וקיניתים^7,14,15. כאן, אנו מספקים את הפרטים של טיהור ו-olig, הוספת תוויות של מנועים מ שמרים^{7,16,17,18,19,20}, ה קיפול וטיהור של דנ א מקוטע אוריגמי עם תאימות tunable⁸, ואת הדמיה של מנועי שמרים דוחף את המבנים מארז^7,18.

בניית הרכבים מוטוריים להתבוננות במולקולה בודדת מחוץ למבחנה דורשת שלושה מאמצים ראשוניים. הראשון הוא הביטוי, טיהור ותיוג של בנייה מוטוריים מתאים לחיבור ל-DNA אוריגמי. השני הוא ייצור וטיהור של מבנים מוגדרים DNA אוריגמי (נקרא לעתים קרובות “מארז”). והשלישי הוא הקוניוגציה של המנועים למבנה המארז ואחריו התבוננות באמצעות מיקרוסקופ כולל של השתקפות פנימית (TIRF). כאן, אנו מספקים פרוטוקולים הוקמה עבור תהליך זה עבור מנועים רקומביננטי מבוססי מיקרוטוכדורית מטוהרים מתוך שמרים סכביסים cerevisiae ס^{7,16,17,18, 19}. DNA אוריגמי-מבוססי הרכבים מוטוריים נחקרו באמצעות שני רקומביננטי קינזין¹⁵ ו דינאין^{7,8, 18 בנייה} המיוצר במערכת זו ביטוי שמרים^{16 ,17,18,19}. פרוטוקול זה תקף עבור מבנים אלה, בהתחשב בכך שהם נשלטים על ידי היזם המושרה גלקטוז, ו התמזגו לתגי חלבון זהה עבור טיהור (ZZ ו-TEV פרוטאז מקשר) ו עבור הקונגו DNA oligo (SNAPtag).

זנים שמרים ספציפיים לייצר בונה מנוע ספציפי. לדוגמה, the דינאין המשמש לחקר את התפקיד של ציות מטענים היה מטוהר הזנים RPY1084^7,8. באופן כללי, זנים המכילים מבנים במבנים עם השינויים הגנטיים המתאימים לביטוי וטיהור ניתן לבקש ממעבדות לאחר שפרסמו את השימוש במנועים אלה. בנייה עם תכונות הרומן כגון מוטציות או תגים יכולים להתבצע באמצעות טכניקות גנטיות רקומביננטי, כגון שינוי ליתיום אצטט²¹ ערכות מסחריות. פרוטוקולים מפורטים ליצירת חלבונים מוטוריים שונה ב שמרים עבור מחקרים מולקולה אחת פורסמו¹⁹. בנוסף מנועי להיות התמזגו SNAPtag, האוליגוס המשמש תווית המנועים חייב להיות מחובר המצע הצמד, בנזיל (BG); פרוטוקולים שפורסמו בעבר מתארים את היווצרות וטיהור של שערים BG-oligo¹⁸. האסטרטגיה הכוללת המתוארת כאן גם היא מועסק עבור actin מבוססי מנועים (ראה עבודות קודמות לדוגמאות^22,23,24), ומנועים מטוהרים ממערכות אחרות של אורגניזמים וביטויים (ראה קודם עבודות לדוגמא^{7,9,10,11,12,13,14}.

מיקרוטובולים פלגניים (MTs) משמשים בניסויים אלה בשני הליכים שונים. הר האהדה לטיהור של מנועים פונקציונליים דורש mts שאינם מסומנים עם קבוצות פונקציונליות אחרות, בעוד ההרכב מנוע הרכב מצריך mts עם התווית ביוטין ו fluorophores. בכל מקרה, MTs מיוצבים עם מטקרול כדי למנוע דנטורציה. השלב לטיהור אהדה של MT משמש כדי להסיר כל מנועים שאינם מורעפים עם זיקה גבוהה MT, כמו מנועים אלה יכולים לשנות את ההרכב תנועתיות אם מצושל למארז. במהלך תהליך זה, פעילים מנועים להסיר את MTs ולהישאר בפתרון, בעוד מנועים הדוקה מחייב ספין למטה בתוך הגלולה MT. פעולה זו מסייעת להבטיח שכל המנועים במארז הם מאוכלוסיה פעילה.

מגוון של מבנים DNA אוריגמי שימשו לחקר הרכבים מוטוריים ציטושלד. כמו הבנה מכניסטית של התחבורה הרכב גדל, מבנים DNA אוריגמי מועסקים ניסויים גדלו במורכבות. בעיקרון, כל מבנה יכול להיות מותאם למטרה זו בתנאי שהוא שונה כדי לכלול בודד תקוע באתר המצורף דנ א עבור מנועים ו-fluorophores. עיצובים ותכונות מארזים ספציפיים עשויים להיות שימושיים לחטט שאלות מסוימות על התנהגות מתהווה של מנועים הרכבים. לדוגמה, מוטות קשיחים שימשו כדי לפתח ידע היסוד של איך עותק מספר משפיע על התחבורה על ידי צוותי dyneins ו קינימות^7,15,18, פלטפורמות 2d שימשו כדי ללמוד רירן אנסמבל ניווט של רשתות אקטין²². מבנים בעלי גמישות משתנה או משתנים שימשו כדי להבין את התפקידים של צימוד אלסטי בין מנועים ולבדוק כיצד הסנכרון משפיע על התנועתיות^8,24. לאחרונה, מבנים כדוריים משמשים כדי לקבל תובנה כיצד אילוצים גיאומטריים על כריכת מנוע המנוע להשפיע על הדינמיקה של תנועתיות²⁵.

בפרוטוקול זה, אנו מציעים צעדים ספציפיים עבור ניסויים אנסמבל על מארז מקוטע עם קשיחות משתנה. אתרי איגוד במארז מכונים לעיתים “ידיות”, בעוד רצפי DNA משלימים הקושרים ידיות אלה נקראים “antihandles”. מספר המנועים במארז האלה נקבע באמצעות אילו מקטעים מכילים סיכות אחיזה מורחבות עם משלימה את הטיפול במנועים באמצעות מנועי התווית האוליגו. שימוש ברצפי אחיזה שונים במקטעים שונים מאפשר כריכה של סוגים שונים של מנועים למיקומים ספציפיים במארז. המארז המפורט כאן מורכב מ -7 מקטעים קשיחים רציפים, כל אחד מהם מורכב מ-12 סוגי דנ א כפולים שאורגנו ב -2 טבעות קונצנטריים⁸. החלקים נוקשה מכילים את ידיות מנוע מחוברים באמצעות אזורים שיכולים להיות גמישים אחד תקוע בודד או דנ א נוקשה כפול, בהתאם היעדרות או נוכחות, בהתאמה, של “מקשר” סיכות. הציות למבנה המארז נקבע על ידי הימצאות או העדר הסיכות הללו. ראה דוחות קודמים לפרטים נוספים ורצפי DNA ספציפיים⁸. בנוסף, ניתן להשתמש בשיטות מרובות לטיהור מארז²⁶. הקצב-מעבר הדרגתי צנטריפוגה שיטה²⁷ מתואר כאן.