إنتاج Dynein و Kinesin موتور الفرق علي الحمض النووي اوريغامي النانو لرصد جزيء واحد

Dynein و كينيسن هي بروتينات المحرك خلوي المسؤولة عن وظائف لا تعد ولا تحصي في الخلايا حقيقية النواة¹. عن طريق تحويل الطاقة الكيميائية من التحلل ATP في العمل الإنتاجي ، وهذه المحركات translocate علي الأنابيب الدقيقة لسحب وتوزيع الشحنات داخل الخلايا المختلفة. كما انها تنسق في الترتيبات الضخمة داخل الخلايا المرتبطة بالانقسام ، حيث تظهر القوي المدبرة التي تسهم في تحديد المواقع وفصل الكروموسومات. وقد كشفت الفحوصات الهيكلية والبيوكيميائية والبيوفيزيائية ، بما في ذلك ملاحظات جزيء واحد ، أليات هذه المحركات علي المستوي الفردي (المراجعة الجيدة في الاعمال السابقة^2،3،4). ومع ذلك ، فان العديد من مهام المحركات تتطلب منهم العمل في فرق صغيره من أنواع المحركات المتشابهة والمختلطة. نسبيا اقل فهمت حول اليه ان ينسق النشاط وحركيه طارئه مطلقه من هذا فرق^5,6. وتعزي هذه الفجوة المعرفية ، جزئيا ، إلى صعوبة إنشاء الفرق ذات الميزات القابلة للتحكم ، مثل نوع المحرك ورقم النسخة. علي مدي العقد الماضي ، تم استخدام تقنيات البناء الجزيئية من اوريغامي الحمض النووي لحل هذه المشكلة. للمحركات القائمة علي ميكروتثبول ، وتشمل بعض الامثله علي هذه التحقيقات ملاحظات جزيء واحد من الفرق من dynein سيتوبلاسميك-1^7،8،9، داخل الشركات¹¹، مختلفه [كينسن] محركات^12,13, وخلطاء من كلا [ديينس] و [كينينس]^7,14,15. هنا ، ونحن نقدم تفاصيل عن تنقيه والتسميات قله الكريات^السبعمن المحركات من الخميرة 7^{،16،17،18،19،20}، و للطي وتنقيه اوريغامي الحمض النووي مجزاه مع الامتثال انضباطي⁸، والتصوير من المحركات الخميرة دفع هياكل الشاسيه^7،18.

بناء السيارات الفرق لرصد جزيء واحد في المختبر يتطلب ثلاثه جهود أساسيه. الأول هو التعبير ، وتنقيه ووضع العلامات من السيارات بنيات مناسبه لربط إلى اوريغامي الحمض النووي. والثاني هو إنتاج وتنقيه الهياكل المحددة اوريغامي الحمض النووي (تسمي في كثير من الأحيان “الشاسيه”). والثالث هو اقتران المحركات بهيكل الشاسيه متبوعا بالملاحظة باستخدام المجهر الداخلي الكلي للانعكاس (TIRF). هنا ، ونحن نقدم البروتوكولات المعمول بها لهذه العملية للمحركات المؤتلف المستندة إلى ميكروتوبولي المنقية من الخميرة ساكاروميسز سيريفيسياي^{7،16،17،18، 19}. وقد تم التحقيق في الفرق المحركات القائمة علي الحمض النووي اوريغامي باستخدام كل من المؤتلف كينيسن¹⁵ و dynein^7,8,18 يبني في هذا النظام التعبير الخميرة^{16 و17و18و19}. هذا البروتوكول هو صالح لهذه الثوابت ، بالنظر إلى ان يتم التحكم بها من قبل المروج المستحثة الغالاكتوز ، وتنصهر في نفس علامات البروتين لتنقيه (ZZ و tev الانزيم البروتيني رابط) والاقتران الحمض النووي اليغو (snaptag).

سلالات الخميرة محدده تنتج بنيات المحرك محدده. علي سبيل المثال ، تم تنقيه dynein المستخدمة لدراسة دور الامتثال البضائع من سلاله RPY1084^7،8. وبصفه عامه ، يمكن طلب السلالات التي تحتوي علي ثوابت حركيه مع التعديلات الجينية المناسبة للتعبير والتنقية من المختبرات التي نشرت استخدام تلك المحركات. ويمكن اجراء الثوابت ذات السمات الجديدة مثل الطفرات أو العلامات باستخدام التقنيات الوراثية المؤتلفة ، مثل تحويل خلات الليثيوم²¹ والمجموعات التجارية. وقد نشرت بروتوكولات مفصله لإنشاء بروتينات المحركات المعدلة في الخميرة لدراسات جزيء واحد¹⁹. بالاضافه إلى المحركات يجري تنصهر إلى SNAPtag ، والتي تستخدم لتسميه المحركات يجب ان يكون مترافق إلى الركيزة المفاجئة ، البنزيلغوانين (BG) ؛ البروتوكولات المنشورة سابقا تصف تشكيل وتنقيه BG-oligo تستحضر¹⁸. وقد استخدمت الاستراتيجية العامة الموصوفة هنا أيضا للمحركات القائمة علي actin (انظر الاعمال السابقة للاطلاع علي الامثله^22و23و24) والمحركات المنقية من الكائنات الحية الأخرى وأنظمه التعبير (انظر السابق يعمل لمثل الامثله^{7،9،10،11،12،13،14}).

وتستخدم الأنابيب المجهرية بلمره (MTs) في هذه التجارب في إجراءين مختلفين. MT التقارب تنقيه المحركات الوظيفية يتطلب MTs التي لا توصف مع المجموعات الوظيفية الأخرى ، في حين ان المحرك الفرقة الحركة TIRF الفحص يتطلب MTs المسمية مع البيوتين والفلوماتورس. في جميع الحالات ، يتم تثبيت MTs مع تاكسول لمنع التشبع. يتم استخدام خطوه تنقيه التقارب MT لأزاله اي المحركات غير motile مع تقارب MT عاليه ، كما يمكن لهذه المحركات تغيير الحركة الفرقة إذا مترافق إلى الشاسيه. اثناء هذه العملية ، المحركات النشطة إلغاء ربط MTs والبقاء في الحل ، بينما المحركات ملزمه ضيق تدور في بيليه MT. وهذا يساعد علي ضمان ان جميع المحركات علي الشاسيه هي من السكان النشطين.

وقد استخدمت مجموعه متنوعة من الهياكل اوريغامي الحمض النووي لدراسة الفرق المحركات خلوي. وبما ان الفهم الألى لنقل الفرقة قد زاد ، فقد نمت هياكل اوريغامي الحمض النووي المستخدمة في التجارب في التعقيد. ومن حيث المبدا ، يمكن تكييف اي هيكل لهذا الغرض شريطه تعديله ليشمل مواقع مرفقات الحمض النووي الوحيدة التي تقطعت بها السبل للمحركات والفلوبوريس. تصاميم الشاسيه المحددة والسمات قد تكون مفيده لسبر اسئله معينه حول السلوك الناشئة من الفرق المحركات. علي سبيل المثال ، وقد استخدمت قضبان جامده لتطوير المعرفة التاسيسيه لكيفيه تاثير عدد النسخ يؤثر علي النقل من قبل فرق من dyneins و kinesins^7،15،18، وقد استخدمت منصات 2d لدراسة فرقه ميوزين الملاحة من شبكات الاكتين²². وقد استخدمت الهياكل ذات المرونة المتغيرة أو القابلة للتوقد لفهم ادوار الاقتران المرن بين المحركات والتحقيق في كيفيه تاثير التزامن المتدرج علي الحركة^8،24. وفي الاونه الاخيره ، يتم استخدام الهياكل الكروية لاكتساب نظره ثاقبه حول كيفيه تاثير القيود الهندسية علي الربط الحركي للمسار علي ديناميات الحركة²⁵.

في هذا البروتوكول ، نحن نقدم خطوات محدده لتجارب الفرقة علي الشاسيه مجزاه مع صلابة متغير. ويشار أحيانا إلى المواقع الملزمة علي الشاسيه باسم “المقابض” ، بينما يطلق علي سلاسل الحمض النووي التكميلية التي تربط هذه المقابض “مضادات المقابض”. يتم تحديد عدد من المحركات علي هذه الشاسيه من قبل الشرائح التي تحتوي علي الدبابيس مقبض الموسعة مع التكامل إلى اليغو مضاده للمقبض علي المحركات المسمي اليغو. يسمح استخدام تسلسلات مختلفه من المؤشرات علي أجزاء مختلفه بربط أنواع مختلفه من المحركات بمواقع محدده علي الشاسيه. يتكون الهيكل المفصل هنا من 7 قطع جامده متسلسلة ، يتالف كل منها من 12 من الحمض النووي المزدوج الذي يتم ترتيبه في حلقتين من الحلقتين المتمركزتين⁸. الأجزاء جامده تحتوي علي مقابض المحركات وترتبط من خلال المناطق التي يمكن ان تكون مرنه اما الحمض النووي الوحيد الذي تقطعت به السبل أو جامده مزدوجة تقطعت بهم السبل الحمض النووي ، اعتمادا علي غياب أو وجود ، علي التوالي ، من المواد الغذائية “رابط”. التالي فان الامتثال للهيكل هيكل يتحدد من خلال وجود أو غياب هذه “رابط” المواد الغذائية. انظر التقارير السابقة لمزيد من التفاصيل وتسلسل الحمض النووي المحدد⁸. الاضافه إلى ذلك ، يمكن استخدام طرق متعددة لتنقيه الشاسيه²⁶. ويرد هنا وصف لطرد التدرج الجلسرين بالنسبة للمناطق المعدلة²⁷ .