Микроспутниковая ДНК Генотипирование и поток Цитометрия Плоиди Анализ формалин фиксированной Парафин-встроенный Hydatidiform Моляровые ткани
Summary
Hydatidiform моли являются ненормальные беременности человека с разнородными этиологиями, которые могут быть классифицированы в соответствии с их морфологических особенностей и родительского вклада в молярового геномов. Здесь подробно описаны протоколы мультиплексной микроспутниковой ДНК генотипирования и цитометрии потока формалино-фиксированных парафин-встроенных моляровских тканей, а также интерпретации результатов и интеграции.
Abstract
Hydatidiform моль (HM) является ненормальной человеческой беременности характеризуется чрезмерным трофиобластным пролиферацией и аномальным эмбриональным развитием. Существует два типа HM на основе микроскопической морфологической оценки, полный HM (CHM) и частичный HM (PHM). Они могут быть дополнительно подразделены на основе родительского вклада в моляровские геномы. Такая характеристика HM, морфологии и генотипа анализов, имеет решающее значение для управления пациентом и для фундаментального понимания этой интригующей патологии. Хорошо задокументировано, что морфологический анализ Hm подвержен широкой изменчивости межнаблюдателей и не является достаточным сам по себе, чтобы точно классифицировать HM в CHM и PHM и отличить их от гидропиковых немолярных абортов. Генотипный анализ в основном проводится на ДНК и тканях из формалино-фиксированных парафин-встроенных (FFPE) продуктов зачатия, которые имеют меньше, чем оптимальное качество и, следовательно, может привести к неправильным выводам. В этой статье предоставляются подробные протоколы для мультиплексного генотипирования и цитометрии потока, а также интерпретация результатов этих методов, их устранение неполадок и интеграция с морфологической оценкой , p57KIP2 иммуногистохимия, и флуоресценция на месте гибридизации (FISH) для достижения правильной и надежной диагностики. Здесь авторы делятся методами и уроками, извлеченные за последние 10 лет из анализа примерно 400 продуктов зачатия.
Introduction
Гиматидиформная родинка (Hm) является ненормальной человеческой беременности характеризуется аномальным эмбриональным развитием, гиперраспространением трофобласта и гидропикной дегенерацией хорионического вилли (CV). Исторически сложилось так, что HM раньше был разделен на два типа, полный HM (CHM) и частичный HM (PHM) на основе только морфологической оценки1. Тем не менее, было показано, что морфологическая оценка сама по себе не является достаточной, чтобы классифицировать HM в два подтипа (CHM и PHM) и отличить их от немолярных выкидышей2,3,4.
Поскольку CHM и PHM имеют различные склонности к злокачественным новообразованиям, поэтому важно точно определить генотипический тип HM, чтобы обеспечить надлежащее наблюдение и управление пациентами. Следовательно, в последние десятилетия было разработано и разработано несколько методологий с целью выявления вклада родителей в моляровые ткани и достижения правильной классификации НМ. К ним относятся кариотипный анализ, хромосомный полостальный полиморфизм, антиген лейкоцита человека (HLA) серологический типизон, полиморфизм длины фрагмента ограничения, переменное количество тандемных повторов, микроспутниковая генотипирование, цитометрия потока и p57 KIP2 иммуногистохимия. Это позволило точное разделение HM концепций на основе родительского вклада в их геномы, а именно: CHM, которые являются диплоидных андрогенетических моноспермных или диплоидных андрогенетических диспермических, и PHM, которые являются триплоид, диспермические в 99% и моноспермный в 1% случаев5,6,7,8. Кроме того, есть еще один генотипический тип HM, который появился в последние два десятилетия, который является диплоидный biparental. Последнее в основном повторяются и может повлиять на одного члена семьи (простые случаи) или, по крайней мере, двух членов семьи (семейные случаи). Эти диплоидные дьюдетские родинки в основном вызваны рецессивными мутациями в NLRP7 или KHDC3L у пациентов9,10,11,12. Диплоид ный родитель HM у пациентов с рецессивными мутациями в NLRP7 может быть диагностирован как CHM или PHM морфологическим анализом, и это, как представляется, связано с тяжестью мутаций у пациентов13,14. В дополнение к классификации HM в соответствии с их генотипами, введение и использование нескольких методов генотипирования позволило различать различные молярые сущности от немолянных выкидышей, таких как анеплодоидные диплоидные двухродительские концепции и другие типы зачатий5,15. Такие концепции могут иметь некоторое распространение трофобластов и ненормальную злобную морфологию, которые в некоторой степени имитируют некоторые морфологические особенности Hm.
Целью данной статьи является предоставление подробных протоколов для мультиплексной генотипирования и цитометрии сфиксированными парафиновыми (FFPE) тканями, а также комплексный анализ результатов этих методов и их интеграция с другими методами правильный и убедительный диагноз моляровских тканей.
Protocol
Representative Results
Discussion
HM являются ненормальные человеческие беременности с разнородными этиологии и имеют различные гистологические и генотипические типы, что делает их точной классификации и диагностики сложной задачей. Гистопатологическая морфологическая оценка часто оказывалась неточной и поэтому са…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят Софи Патриер и Марианну Пареси за совместное использование оригинального протокола цитометрии потока, а также Promega и Qiagen за поставки материалов и реагентов. Эта работа была поддержана Репродукцией Репродукции Репродукции Ребикуи и Канадским институтом исследований в области здравоохранения (MOP-130364) в Р.С.
Materials
| BD FACS Canto II | BD BioSciences | 338960 | |
| Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer | Applied biosystems | 313001R | Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca) |
| Citric acid | Sigma | 251275 | |
| Cytoseal 60, histopathology mounting medium | Fisher | 23244257 | |
| Eosin Y stock solution (1%) | Fisher | SE23-500D | |
| FCSalyzer – flow cytometry analysis software | SourceForge | – | https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/ |
| FFPE Qiagen kit | Qiagen | 80234 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | For sectioning and for the cleaning process |
| Glacial Acetic Acid (Concentrated) | Sigma | A6283-500mL | |
| Glass coverslips: Cover Glass | Fisher | 12-541a | |
| Hematoxylin | Fisher | CS401-1D | |
| Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide | Thermofisher | 4311320 | |
| IHC platform: Benchmark Ultra | Roche | – | |
| Kimwipes | Ultident | 30-34120 | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Microtome blades | Fisher | 12-634-1C | |
| Nitex filtering mesh, 48 microns | Filmar | 74011 | http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company |
| p57 antibody | Cell Marque | 457M | |
| Pasteur pipette | VWR | 53499-632 | |
| PCR machine | Perkin Elmer, Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| PeakScanner 1.0 | Applied Biosystems | 4381867 | Software for genotyping analysis. |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7012 | |
| Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm | Fisher | 1255015 | |
| PowerPlex 16 HS System | Promega Corporation | DC2102 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4864 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma | R4875 | |
| Separation matrix: POP-7 Polymer | Thermofisher | 4352759 | |
| UltraPure Agarose | Fisher | 16500-500 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
- Szulman, A. E., Surti, U. The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).
- Fukunaga, M., et al. Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole. The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).
- Gupta, M., et al. Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).
- Howat, A. J., et al. Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy?. Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).
- Banet, N., et al. Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping. Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).
- Lipata, F., et al. Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole. Obstetrics & Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).
- Buza, N., Hui, P. Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).
- Fisher, R. A., et al. Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes. Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).
- Murdoch, S., et al. Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans. Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).
- Parry, D. A., et al. Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte. American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).
- Nguyen, N. M., Slim, R. Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling. Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).
- Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations. Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).
- Nguyen, N. M., et al. Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation. Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).
- Brown, L., et al. Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either “partial” or “complete” hydatidiform moles. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).
- Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping. The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).
- Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay. The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).
