Pulitura del DNA microsatellite e citometria di flusso Ploidy Analisi dei tessuti molari Molari Molari Molar fissati di paraffino fissati in parina
Summary
Le talpe idatidiformi sono gravidanze umane anomale con aeziologie eterogenee che possono essere classificate in base alle loro caratteristiche morfologiche e al contributo dei genitori ai genomi molare. Qui, i protocolli di genotipizzazione del DNA microsatellite multiplex e citometria di flusso dei tessuti molari incorporati in paraffina fissati in formalina sono descritti in dettaglio, insieme all’interpretazione e all’integrazione dei risultati.
Abstract
La talpa idatidiforme (HM) è una gravidanza umana anomala caratterizzata da un’eccessiva proliferazione trofoblastica e da uno sviluppo embrionale anormale. Esistono due tipi di HM basati sulla valutazione morfologica microscopica, HM completo (CHM) e HM parziale (PHM). Questi possono essere ulteriormente suddivisi in base al contributo dei genitori ai genomi molare. Tale caratterizzazione dell’HM, mediante morfologia e analisi del genotipo, è fondamentale per la gestione del paziente e per la comprensione fondamentale di questa patologia intrigante. È ben documentato che l’analisi morfologica dell’HM è soggetta ad ampia variabilità interosservante e non è sufficiente da sola per classificare con precisione HM in CHM e PHM e distinguerli dagli aborti idropici non molare. L’analisi della genotipizzazione viene eseguita principalmente su DNA e tessuti da prodotti di concezione incorporati in paraffina fissata in formalina (FFPE), che hanno una qualità inferiore a quella ottimale e possono quindi portare a conclusioni errate. In questo articolo vengono forniti protocolli dettagliati per la genotipizzazione multiplex e l’analisi della citometria di flusso dei tessuti molari FFPE, insieme all’interpretazione dei risultati di questi metodi, alla loro risoluzione dei problemi e all’integrazione con la valutazione morfologica , l’immunosofochimicap57 KIP2 e l’ibridazione in situ (FISH) della fluorescenza in situ per raggiungere una diagnosi corretta e robusta. Qui, gli autori condividono i metodi e le lezioni appresi negli ultimi 10 anni dall’analisi di circa 400 prodotti di concepimento.
Introduction
Una talpa idatidiforme (HM) è una gravidanza umana anomala caratterizzata da sviluppo embrionale anormale, iperproliferazione del trofoblasto e degenerazione ipicca di villi cirionico (CV). Storicamente, HM era diviso in due tipi, HM completo (CHM) e HM parziale (PHM) basato solo sulla valutazione morfologica1. Tuttavia, è stato dimostrato che la valutazione morfologica da sola non è sufficiente per classificare HM nei due sottotipi (CHM e PHM) e distinguerli da aborti non molori2,3,4.
Poiché CHM e PHM hanno diverse propensioni alle neoplasie, è quindi importante determinare con precisione il tipo genotypic di HM per fornire un adeguato follow-up e gestione ai pazienti. Di conseguenza, negli ultimi decenni, diverse metodologie sono state sviluppate ed evolute allo scopo di identificare il contributo dei genitori ai tessuti molari e raggiungere una corretta classificazione dell’HM. Questi includono l’analisi del cariotipo, il polimorfismo delle bande cromosomiche, la tipiagrafia sierologica dell’antigene leucocito umano (HLA), il polimorfismo della lunghezza del frammento di restrizione, il numero variabile di ripetizioni tandem, la genotipizzazione dei microsatelliti, la citometria di flusso e il p57 immunohistochimica KIP2. Ciò ha permesso una suddivisione accurata delle concezioni HM in base al contributo dei genitori al loro genoma, come segue: CHM, che sono diploidi androgenetici o diploidi dispermiati, e PHM, che sono triploidi, dispermiche nel 99% e monospermico nell’1% dei casi5,6,7,8. Inoltre, c’è un altro tipo genotypic di HM che è emerso negli ultimi due decenni, che è biparentalo diploide. Quest’ultimo è per lo più ricorrente e può interessare un singolo membro della famiglia (casi simplex) o almeno due membri della famiglia (casi familiari). Queste talpe biparentali diploidi sono per lo più causate da mutazioni recessive in NLRP7 o KHDC3L nei pazienti9,10,11,12. Diploid biparentalHM in pazienti con mutazioni recessive in NLRP7 può essere diagnosticato come CHM o PHM da analisi morfologica e questo sembra essere associato con la gravità delle mutazioni nei pazienti13,14. Oltre alla classificazione della HM in base ai loro genotipi, l’introduzione e l’uso di diversi metodi di genotipizzazione hanno permesso la distinzione delle varie entità molare da aborti spontanei non molari, come le concezioni biparentali diploidi aneuploidi e altri tipi di concezioni5,15. Tali concezioni possono avere una certa proliferazione di trofoblasti e una morfologia villosa anormale che imitano, in una certa misura, alcune caratteristiche morfologiche di HM.
Lo scopo di questo articolo è quello di fornire protocolli dettagliati per la genotipizzazione multiplex e la citometria di flusso dei tessuti incorporati in paraffina fissata alla formalina (FFPE), nonché analisi complete dei risultati di questi metodi e della loro integrazione con altri metodi per diagnosi corretta e conclusiva dei tessuti molari.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le HM sono gravidanze umane anormali con eziologie eterogenee e hanno diversi tipi istologici e genotypic, il che rende la loro classificazione e diagnosi accurate impegnative. La valutazione morfologica istopatologica è stata spesso dimostrata imprecisa ed è quindi inaffidabile da sola per classificare HM in CHM e PHM e distinguerli da aborti non molari. Pertanto, una diagnosi accurata di HM richiede l’uso di altri metodi come la genotipizzazione del DNA microsatellite multiplex, l’analisi della ploidia per citometria…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori ringraziano Sophie Patrier e Marianne Parésy per aver condiviso il protocollo originale della citometria di flusso, e Promega e Qiagen per la fornitura di rifornimenti e reagenti. Questo lavoro è stato sostenuto dal Réseau Québécois en Reproduction e dal Canadian Institute for Health Research (MOP-130364) a R.S.
Materials
| BD FACS Canto II | BD BioSciences | 338960 | |
| Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer | Applied biosystems | 313001R | Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca) |
| Citric acid | Sigma | 251275 | |
| Cytoseal 60, histopathology mounting medium | Fisher | 23244257 | |
| Eosin Y stock solution (1%) | Fisher | SE23-500D | |
| FCSalyzer – flow cytometry analysis software | SourceForge | – | https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/ |
| FFPE Qiagen kit | Qiagen | 80234 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | For sectioning and for the cleaning process |
| Glacial Acetic Acid (Concentrated) | Sigma | A6283-500mL | |
| Glass coverslips: Cover Glass | Fisher | 12-541a | |
| Hematoxylin | Fisher | CS401-1D | |
| Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide | Thermofisher | 4311320 | |
| IHC platform: Benchmark Ultra | Roche | – | |
| Kimwipes | Ultident | 30-34120 | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Microtome blades | Fisher | 12-634-1C | |
| Nitex filtering mesh, 48 microns | Filmar | 74011 | http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company |
| p57 antibody | Cell Marque | 457M | |
| Pasteur pipette | VWR | 53499-632 | |
| PCR machine | Perkin Elmer, Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| PeakScanner 1.0 | Applied Biosystems | 4381867 | Software for genotyping analysis. |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7012 | |
| Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm | Fisher | 1255015 | |
| PowerPlex 16 HS System | Promega Corporation | DC2102 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4864 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma | R4875 | |
| Separation matrix: POP-7 Polymer | Thermofisher | 4352759 | |
| UltraPure Agarose | Fisher | 16500-500 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
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