التحليل الخلوي للحمض النووي الثنائي الميكروي والتدفق المضخم للخلايا من Formalin-الثابتة البارافين-جزءا لا يتجزا من الانسجه المولية
Summary
الشامات الوراثية هي حالات الحمل البشري غير الطبيعية مع المسببات غير المتجانسة التي يمكن تصنيفها وفقا لخصائصها المورفولوجية ومساهمه الوالدين في الجينوم المولي. وفي هذا الصدد ، توصف بالتفصيل البروتوكولات المتعلقة بالتنميط الجيني للحمض النووي المتعدد الميكروي وتدفق الخلايا الخلوية من فورمالين-الانسجه المولية الثابتة من البارافين ، إلى جانب تفسير النتائج وتكاملها.
Abstract
الخلد hydatidiform (HM) هو الحمل البشري غير طبيعيه تتميز الانتشار المفرط تروفوبلاستيك والتنمية الجنينية غير طبيعيه. هناك نوعان من HM استنادا إلى التقييم المورفولوجية المجهرية ، كامله HM (اليه تبادل أليات) وجزئيه HM (PHM). ويمكن تقسيمها بشكل أكبر علي أساس مساهمه الوالدين في الجينوم المولي. هذا التوصيف لل HM ، من خلال تحليلات المورفولوجية والنمط الجيني ، هو أمر حاسم لأداره المرضي والفهم الأساسي لهذه الامراض المثيرة للاهتمام. ومن الموثق جيدا ان التحليل المورفولوجية لصاحبه الجلالة يخضع لتقلبات واسعه بين المراقبين وليس كافيا من تلقاء نفسه لتصنيفها بدقه في اليه تبادل أليات و PHM وتمييزها عن الإجهاض المائي غير المولي. يتم اجراء تحليل التنميط الجيني في الغالب علي الحمض النووي والانسجه من فورمالين-الثابتة البارافين-جزءا لا يتجزا من المنتجات (FFPE) من الحمل ، والتي لديها اقل من الجودة المثلي ، التالي قد يؤدي إلى استنتاجات خاطئه. في هذه المقالة ، يتم توفير بروتوكولات مفصله للتحليل الجيني متعدد الخلايا وتحليلات التدفق الخلوي للانسجه المولية FFPE ، جنبا إلى جنب مع تفسير نتائج هذه الأساليب ، واستكشاف الأخطاء وإصلاحها ، والتكامل مع التقييم المورفولوجية ، p57KIP2 مناعي ، والتهجين في الموقع (FISH) للوصول إلى تشخيص صحيح وقوي. وفي هذا الصدد ، يتقاسم المؤلفون الأساليب والدروس المستفادة في السنوات العشر الماضية من تحليل ما يقرب من 400 منتجا من الحمل.
Introduction
والخلد الورم (HM) هو الحمل البشري غير طبيعيه تتميز النمو الجنيني غير طبيعي ، فرط انتشار تروفوبلاست ، وانحطاط هيدروبيك من الزغب المشيميه (CV). تاريخيا ، كانت HM تنقسم إلى نوعين ، كامله HM (اليه تبادل أليات) وجزئيه HM (PHM) استنادا فقط علي التقييم المورفولوجية1. ومع ذلك ، فقد تبين ان التقييم المورفولوجية وحده لا يكفي لتصنيف HM في النوعين الفرعيين (اليه تبادل أليات و phm) وتمييزها عن الإجهاض غير المولي2،3،4.
لان اليه تبادل أليات و PHM لها ميول مختلفه إلى الأورام الخبيثة ، ولذلك فمن المهم ان تحدد بدقه نوع النمط الجيني من HM لتوفير المتابعة المناسبة والاداره للمرضي. ونتيجة لذلك ، تم في العقود الماضية وضع وتطوير عده منهجيات لغرض تحديد مساهمه الوالدين في الانسجه المولية والتوصل إلى تصنيف صحيح لصاحبه الجلالة. وتشمل هذه تحليل النمط الحقيقي ، وتعدد الكروموسومات النطاقات ، البشرية مستضد الكريات البيضاء (هلا) الكتابة المصلية ، وتقييد طول الجزء المتعدد الاشكال ، وعدد متغير من تكرار ترادفي ، التنميط الجيني الميكروي ، والتدفق الخلوي ، و p57 KIP2 مناعي. وقد سمح هذا التقسيم الدقيق لمفاهيم HM استنادا إلى مساهمه الوالدين في الجينوم الخاصة بهم ، علي النحو التالي: اليه تبادل البيانات ، والتي هي أحاديه اللون andropermic أو مضاعف التشتت اندروجيني ، و phm ، والتي هي triploid ، التشتت في 99 ٪ و أحاديه الميكروفون في 1 ٪ من الحالات5،6،7،8. وعلاوة علي ذلك ، هناك نوع آخر من النمط الجيني من HM التي ظهرت في العقدين الماضيين ، وهو ثنائي اللون ثنائيه اللون. وهذه الاخيره متكررة في معظمها وقد تؤثر علي فرد واحد من افراد الاسره (الحالات البسيطة) أو علي ما لا يقل عن فردين من الاسره (الحالات العائلية). هذه الشامات مضاعف ثنائي الطور غالبا ما تسببها طفرات متنحي في NLRP7 أو KHDC3L في المرضي9,10,11,12. Diploid ثنائي الطور HM في المرضي الذين يعانون من طفرات متنحي في NLRP7 يمكن تشخيصها بأنها اليه تبادل أليات أو phm عن طريق التحليل المورفولوجية وهذا يبدو ان تترافق مع شده الطفرات في المرضي13,14. بالاضافه إلى تصنيف HM وفقا لأنماطها الجينية ، سمح إدخال واستخدام العديد من أساليب التنميط الجيني بالتمييز بين مختلف الكيانات المولية من الإجهاض غير المولي ، مثل التصاميم ثنائيه اللون أخرى أنواع التصاميم5,15. هذه المفاهيم قد يكون لها بعض الانتشار تروفوبلاست والشكل الخسيس الشاذة التي تحاكي ، إلى حد ما ، بعض الميزات المورفولوجية من HM.
الغرض من هذه المادة هو توفير بروتوكولات مفصله لتعدد النماذج الجينية وتدفق الخلوية من formalin-الثابتة البارافين-جزءا لا يتجزا من الانسجه (FFPE) ، وتحليلات شامله لنتائج هذه الأساليب وتكاملها مع أساليب أخرى التشخيص الصحيح والقاطع للانسجه المولية.
Protocol
Representative Results
Discussion
HM هي حالات الحمل البشري غير الطبيعية مع المسببات غير المتجانسة ولها أنواع مختلفه من الانسجه والأنماط الجينية ، مما يجعل تصنيفها الدقيق والتشخيص الصعب. وغالبا ما ثبت ان التقييم المورفولوجية غير دقيق وغير موثوق به من تلقاء نفسه لتصنيف HM في اليه تبادل أليات و PHM وتمييزها عن الإجهاض غير المول?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويشكر المؤلفان صوفي باترير وماريان باريسي لمشاركتهما بروتوكول التدفق الخلوي الأصلي ، و Promega و Qiagen لتوفير الإمدادات والكاشفات. وقد حظي هذا العمل بدعم من الهيئة الكندية لأعاده الإنتاج والمعهد الR.S. للبحوث الصحية (MOP-130364) إلى المركز الكوري لبحوث الصحة.
Materials
| BD FACS Canto II | BD BioSciences | 338960 | |
| Capillary electrophoresis instrument: Genomes Applied Biosystems 3730xl DNA Analyzer | Applied biosystems | 313001R | Service offered by the Centre for Applied Genomics (http://www.tcag.ca) |
| Citric acid | Sigma | 251275 | |
| Cytoseal 60, histopathology mounting medium | Fisher | 23244257 | |
| Eosin Y stock solution (1%) | Fisher | SE23-500D | |
| FCSalyzer – flow cytometry analysis software | SourceForge | – | https://sourceforge.net/projects/fcsalyzer/ |
| FFPE Qiagen kit | Qiagen | 80234 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11295-51 | For sectioning and for the cleaning process |
| Glacial Acetic Acid (Concentrated) | Sigma | A6283-500mL | |
| Glass coverslips: Cover Glass | Fisher | 12-541a | |
| Hematoxylin | Fisher | CS401-1D | |
| Highly deionized formamide: Hi-Di Formamide | Thermofisher | 4311320 | |
| IHC platform: Benchmark Ultra | Roche | – | |
| Kimwipes | Ultident | 30-34120 | |
| Microtome | Leica | RM2135 | |
| Microtome blades | Fisher | 12-634-1C | |
| Nitex filtering mesh, 48 microns | Filmar | 74011 | http://www.filmar.qc.ca/index.php?filet=produits&id=51&lang=en ; any other filter is suitable, but this is an inexpensive and effective option from a non-research company |
| p57 antibody | Cell Marque | 457M | |
| Pasteur pipette | VWR | 53499-632 | |
| PCR machine | Perkin Elmer, Applied Biosystems | GeneAmp PCR System 9700 | |
| PeakScanner 1.0 | Applied Biosystems | 4381867 | Software for genotyping analysis. |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma | P7012 | |
| Polystyrene round-bottom tubes | BD Falcon | 352058 | |
| Positively charged slides: Superfrost Plus 25x75mm | Fisher | 1255015 | |
| PowerPlex 16 HS System | Promega Corporation | DC2102 | |
| Propidium Iodide | Sigma | P4864 | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma | R4875 | |
| Separation matrix: POP-7 Polymer | Thermofisher | 4352759 | |
| UltraPure Agarose | Fisher | 16500-500 | |
| Xylene | Fisher | X3P1GAL |
References
- Szulman, A. E., Surti, U. The syndromes of hydatidiform mole. II. Morphologic evolution of the complete and partial mole. American Journal of Obstetrics & Gynecology. 132 (1), 20-27 (1978).
- Fukunaga, M., et al. Interobserver and intraobserver variability in the diagnosis of hydatidiform mole. The American Journal of Surgical Pathology. 29 (7), 942-947 (2005).
- Gupta, M., et al. Diagnostic reproducibility of hydatidiform moles: ancillary techniques (p57 immunohistochemistry and molecular genotyping) improve morphologic diagnosis for both recently trained and experienced gynecologic pathologists. The American Journal of Surgical Pathology. 36 (12), 1747-1760 (2012).
- Howat, A. J., et al. Can histopathologists reliably diagnose molar pregnancy?. Journal of Clinical Pathology. 46 (7), 599-602 (1993).
- Banet, N., et al. Characteristics of hydatidiform moles: analysis of a prospective series with p57 immunohistochemistry and molecular genotyping. Modern Pathology. 27 (2), 238-254 (2014).
- Lipata, F., et al. Precise DNA genotyping diagnosis of hydatidiform mole. Obstetrics & Gynecology. 115 (4), 784-794 (2010).
- Buza, N., Hui, P. Partial hydatidiform mole: histologic parameters in correlation with DNA genotyping. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (3), 307-315 (2013).
- Fisher, R. A., et al. Frequency of heterozygous complete hydatidiform moles, estimated by locus-specific minisatellite and Y chromosome-specific probes. Human Genetics. 82 (3), 259-263 (1989).
- Murdoch, S., et al. Mutations in NALP7 cause recurrent hydatidiform moles and reproductive wastage in humans. Nature Genetics. 38 (3), 300-302 (2006).
- Parry, D. A., et al. Mutations causing familial biparental hydatidiform mole implicate c6orf221 as a possible regulator of genomic imprinting in the human oocyte. American Journal of Human Genetics. 89 (3), 451-458 (2011).
- Nguyen, N. M., Slim, R. Genetics and Epigenetics of Recurrent Hydatidiform Moles: Basic Science and Genetic Counselling. Current Obstetrics and Gynecology Reports. 3, 55-64 (2014).
- Sebire, N. J., Savage, P. M., Seckl, M. J., Fisher, R. A. Histopathological features of biparental complete hydatidiform moles in women with NLRP7 mutations. Placenta. 34 (1), 50-56 (2013).
- Nguyen, N. M., et al. Comprehensive genotype-phenotype correlations between NLRP7 mutations and the balance between embryonic tissue differentiation and trophoblastic proliferation. Journal of Medical Genetics. 51 (9), 623-634 (2014).
- Brown, L., et al. Recurrent pregnancy loss in a woman with NLRP7 mutation: not all molar pregnancies can be easily classified as either “partial” or “complete” hydatidiform moles. International Journal of Gynecologic Pathology. 32 (4), 399-405 (2013).
- Colgan, T. J., Chang, M. C., Nanji, S., Kolomietz, E. A Reappraisal of the Incidence of Placental Hydatidiform Mole Using Selective Molecular Genotyping. The International Journal of Gynecological Cancer. 26 (7), 1345-1350 (2016).
- Murphy, K. M., McConnell, T. G., Hafez, M. J., Vang, R., Ronnett, B. M. Molecular genotyping of hydatidiform moles: analytic validation of a multiplex short tandem repeat assay. The Journal of Molecular Diagnostics. 11 (6), 598-605 (2009).
