C. elegans Embriyonik Gelişimi Analiz Etmek Için Yarı-yüksek-throughput Görüntüleme Yöntemi ve Veri Görselleştirme Araç Seti
Summary
Bu çalışma, embriyogenezin 80-100 C.’de eşzamanlı 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesine olanak tanıyan yarı-yüksek iş letme protokolünü açıklamaktadır. Ayrıca, veri çözümlemesi kolaylaştırmak için görüntü işleme ve görselleştirme araçları dahildir. Bu yöntemlerin özel muhabir suşları ile birleşimi embriyogenezin ayrıntılı olarak izlenmesini sağlar.
Abstract
C. elegans, embriyonik gelişim sırasında hücre kader özelliklerinin ve morfogenetik olayların sistematik analizinde önde gelen sistemdir. Bir sorun embriyogenez dinamik yaklaşık 13 saat bir süre içinde gelişir; bu yarım günlük zaman ölçeği, görüntülenebilen embriyo sayısını sınırlayarak deneylerin kapsamını kısıtlamıştır. Burada, orta zaman çözünürlükte 80-100 embriyoda, 14 farklı koşuldan, tek bir gecede, aynı anda 3D hızlandırılmış gelişim görüntülemesağlayan yarı-yüksek iş letme protokolü açıklıyoruz. Protokol basittir ve nokta ziyaret kapasitesine sahip bir mikroskoba erişimi olan herhangi bir laboratuvar tarafından uygulanabilir. Bu protokolün yararı, mikrop tabakası belirtimi ve morfogenezin önemli yönlerini görselleştirmek için optimize edilmiş floresan işaretleri ifade eden iki özel olarak üretilmiş suşları görüntülemek için kullanılarak gösterilmiştir. Verileri analiz etmek için, tüm kanallarda, z adımlarında ve zaman noktalarında tek tek embriyoları daha geniş bir görüş alanından eken ve her embriyo için dizileri ayrı bir tiff yığınına kaydeden özel bir program oluşturulmuştür. Kullanıcı dostu bir grafik kullanıcı arabirimi (GUI) içeren program, görselleştirme veya otomatik analize hazırlık olarak bireysel embriyoları izole ederek, ön işlemeye ve tek tip yönlendirerek veri işlemeyi kolaylaştırır. Ayrıca her zaman noktasında her embriyo için maksimum yoğunlukfloresan projeksiyon ve brightfield görüntüleri görüntüleyen bir çok panelli dosya içine bireysel embriyo verileri derleyen bir ImageJ makro. Burada açıklanan protokoller ve araçlar, daha önce tanımlanmış 40 gelişimsel genin yıkılmasından sonra embriyonik gelişimi karakterize etmek için kullanılarak doğrulanmıştır; bu analiz daha önce açıklamalı gelişimsel fenotipleri görselleştirmiş ve yenilerini ortaya koymuştur. Özetle, bu çalışma ayrıntıları bir kırpma programı ve ImageJ görselleştirme aracı ile birleştiğinde bir yarı-yüksek-throughput görüntüleme yöntemi, bilgilendirici floresan belirteçleri ifade suşları ile birleştiğinde, büyük ölçüde analiz etmek için deneyler hızlandırır embriyonik gelişim.
Introduction
C. elegans embriyo mekanistik hücre biyolojisi ve hücre kader özellikleri ve morfogenetik olayların analizi için önemli bir model sistemi embriyonik gelişimsürüş 1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Bugüne kadar, embriyodaki hem hücresel düzeydeki olayların hem de hücre kaderi özelliklerinin karakterizasyonunun büyük bir kısmı, embriyoların her 10-100’de bir kez elde edilmesiyle göreceli olarak yüksek zamansal çözünürlük tesviye si kullanılarak elde edilmiştir. floresan belirteçler. Saniyeler ile on dakika arasında olan olaylar için çok uygun olsa da, bu yaklaşım teknik olarak daha uzun işlemlerin karakterizasyonu için, saat sırasına göre gün sınırlamaolur. Embriyonik gelişim ilk bölünmeden uzama sonuna kadar yaklaşık 10 saat sürer. Bu zaman ölçeğinde, farklı koşullardan daha büyük embriyo kohortlarının aynı anda daha düşük zaman çözünürlüğü görüntülemesini (yani, 5-20 dk zaman aralıklarında edinimi) sağlayacak yarı yüksek iş hacmi yöntemleri yeni bir deney yelpazesi ni açacak; örneğin, sistematik büyük ölçekli tarama çabalarının ve moleküler tedirginliklerin sonuçlarının karşılaştırılması için yeterli sayıda embriyonun analizini sağlamak.
Burada, 80-100 embriyoda, 14 farklı koşullarda, tek bir gecede gelişimin eşzamanlı 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesini sağlayan C. elegans embriyogenezi izlemek için yarı-yüksek iş lenme yöntemini tanımlıyoruz. Protokolün uygulanması kolaydır ve nokta ziyaret yeteneklerine sahip bir mikroskoba erişimi olan herhangi bir laboratuvar tarafından gerçekleştirilebilir. Bu protokoldeki önemli adımlar Şekil 1’deözetlenmiştir. Kısacası, embriyolar ilgi floresan belirteçleri ifade gravid yetişkin ve görüntüleme için 384-well plaka kuyuları genç embriyolar (2-8 hücre evresi) transfer kesilir. Bu formatta, nispeten küçük ve iyi boyutlu huniler embriyoları dar bir alana aktararak, zaman atlamalı görüntüleme için birden fazla embriyo içeren alanların belirlenmesini kolaylaştırır. Embriyo kohort genelinde kabaca senkron gelişimi korumak için, diseksiyonlar soğutulmuş ortamda yapılır ve plaka buz üzerinde tutulur, hangi bir saat süren diseksiyon süresi sırasında önemli gelişmeyi önler. Plaka mikroskoba aktarılır ve embriyolar 2 μm adımlarda tam z aralığı toplamak için, 60x yağ daldırma 1.35 NA lens kullanılarak, 20 dakika zaman aralıkları, bir gecede sıcaklık kontrollü bir odada filme alınır. Her biri 1-5 embriyo içeren elli alan, tek bir gecede görüntülenir. İstenilen deneye bağlı olarak, görüntülenmiş alanların sayısını orantılı olarak azaltarak zaman çözünürlüğü (örneğin, 5-10 dk aralıklarla görüntüleme) artırılabilir.
Bu protokolle, tek bir gecede bile önemli miktarda veri (50 alana yayılmış 80-100 embriyo) üretir ve daha büyük deneyler veri analizi açısından hızla yönetilemez hale gelebilir. Bu verilerin işlenmesini, görselleştirilmesini ve çözümlenmesini kolaylaştırmak için, embriyoları kırpmak ve yönlendirmek ve ön işleme adımlarını (isteğe bağlı) gerçekleştirmek için bir program ve görüntülemeyi kolaylaştırmak için verileri derleyen bir ImageJ makrosu oluşturulmuştür. Bu programlar, yalnızca tek bir parlak alan düzlemi gerektiren görüntüleme yönteminden bağımsız olduklarından, geleneksel yaklaşımlar kullanılarak toplanan görüntüleri işlemek için kullanılabilir. İlk program birden fazla embriyo içeren bir 4D alan alır (GUI seçeneği veya kaynak kodu embryoCrop.py) veya birden fazla embriyo içeren birden fazla 4D alanları (screenCrop.py), sıkıca embriyolar bitkileri ve ön-posterior yapılandırma onları yönlendirir. Bu programlar ayrıca kullanıcılara arka plan çıkarma, sürüklenme düzeltme ve zayıflatma düzeltmesi yapma seçeneği de verir. Elde edilen dosyalar, otomatik görüntü analizi için değiştirilebilir her embriyo için düzgün bir şekilde önceden işlenmiş, sıkıca kırpılmış tiff yığınlarıdır. Her durum için tüm embriyoları görüntülemeyi kolaylaştırmak için, belirli bir durumdan tüm embriyoları tek bir tiff yığınına ve diziparlak görüntülere ve maksimum yoğunluklu projeksiyon rengine monte eden bir ImageJ makrosu (OpenandCombine_embsV2.ijm) yazıldı. RGB) her embriyo için yan yana bindirmeler. Yöntemler, mikrop tabakasının önemli yönlerini görselleştirmek için optimize edilmiş floresan işaretleri ifade eden özel olarak üretilmiş bir çift suşta daha önce tanımlanmış 40 gelişimgenin yıkılmasından sonra embriyonik gelişimi karakterize etmek için kullanılarak doğrulandı. özellikleri ve morfogenez10,11. Birlikte, yarı-yüksek iş letme embriyo görüntüleme protokolü ve görüntü işleme araçları daha yüksek örnek numarası deneyleri ve gelişimsel süreçleri anlamaya yönelik büyük ölçekli tarama çabaları sağlayacaktır. Buna ek olarak, bu suşlar da embriyogenez üzerinde moleküler pertürbations etkilerini incelemek için etkili bir araç sağlayacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu çalışma, C. elegansembriyonik gelişim genlerin işlevini profilini daha büyük ölçekli çabaları sağlamak için geliştirilen araçlar ve yöntemler bir paketi açıklanır. Yarı yüksek iş yöntemimiz, tek bir deneyde 80-100 embriyo için 20 dk çözünürlükte embriyonik gelişimin 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesini sağlar. Bu protokol istenilen herhangi bir belirteç suş (lar) ile kullanılmak üzere adapte edilebilir iken, bu çalışma embriyogenez sırasında olayları izlemek…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.D.O. Ulusal Institute of General Medical Sciences sponsorluğunda University of California San Diego Kurumsal Araştırma ve Akademik Kariyer Geliştirme Ödülü (NIH/IRACDA K12 GM068524) tarafından desteklendi. A.D. ve K.O. Ludwig Kanser Araştırmaları Enstitüsü tarafından desteklendi ve bu da onlara bu çalışmayı desteklemek için kullanılan araştırma fonu sağladı. Biz Andrew Chisholm bu projenin erken aşamalarında yaptığı tavsiye için müteşekkiriz, Ronald Biggs ilk yöntem geliştirme aşamasından sonra bu projeye katkıları için, ve Dave Jenkins ve Andy Shiau destek ve Küçük Molekül Discovery erişim için grubun yüksek içerikli görüntüleme sistemi.
Materials
| Aspirator Tube Assembly | Drummond Scientific | 2-000-000 | |
| Calibrated Pipette (25mL) | Drummond Scientific | 2-000-025 | |
| Cell Voyager Software | Yokogawa Electric Corp | Included with CV1000 | |
| Conical Tube (15 mL ) | USA Scientific | 1475-0501 | |
| CV1000 Microscope | Yokogawa Electric Corp | CV1000 | |
| Depression slide (3-well) | Erie Scientific | 1520-006 | |
| Dissection Microscope | Nikon | SMZ-645 | |
| Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 07336 | |
| ImageJ/FIJI | Open Source | https://imagej.net/Fiji | |
| M9 Buffer | Lab Prepared | https://openwetware.org/wiki/M9_salts | |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mLl) | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Microseal F-foil Seal | Bio-Rad | MSF1001 | |
| NGM Plates | Lab Prepared | http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214 | |
| Scalpel #15 | Bard Parker | REF 371615 | |
| Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom | Greiner Bio-One | 781855 | |
| Tetramisole Hydrochloride | Sigma Aldirch | T1512-10G | |
| Tweezers, Dumont #3 | Electron Microscopy Sciences | 0109-3-PO | |
| U-PlanApo objective (10× 0.4NA) | Olympus | 1-U2B823 | |
| U-PlanApo objective (60× 1.35 NA) | Olympus | 1-U2B832 |
References
- Armenti, S. T., Nance, J. Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis. Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).
- Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. I: development, patterning, and growth. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (6), 861-878 (2012).
- Jackson, B. M., Eisenmann, D. M. beta-catenin-dependent Wnt signaling in C. elegans: teaching an old dog a new trick. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 4 (8), 007948 (2012).
- Lamkin, E. R., Heiman, M. G. Coordinated morphogenesis of neurons and glia. Current Opinion in Neurobiology. 47, 58-64 (2017).
- Loveless, T., Hardin, J. Cadherin complexity: recent insights into cadherin superfamily function in C. elegans. Current Opinion in Cell Biology. 24 (5), 695-701 (2012).
- Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , 1-16 (2005).
- Spickard, E. A., Joshi, P. M., Rothman, J. H. The multipotency-to-commitment transition in Caenorhabditis elegans-implications for reprogramming from cells to organs. FEBS Letters. 592 (6), 838-851 (2018).
- Vuong-Brender, T. T., Yang, X., Labouesse, M. C. elegans Embryonic Morphogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 116, 597-616 (2016).
- Wang, J. T., Seydoux, G. Germ cell specification. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 17-39 (2013).
- Wang, S., et al. A high-content imaging approach to profile C. elegans embryonic development. Development. 146 (7), (2019).
- Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R. N., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J. M., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A. D., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. . Dryad Digital Repository. , (2019).
- Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. . Zenodo. , (2018).
- . Software to crop C. elegans embryos from multi-channel microscopy images Available from: https://github.com/renatkh/embryo_crop (2018)
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. , 1-22 (2005).
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).
- Fakhouri, T. H., Stevenson, J., Chisholm, A. D., Mango, S. E. Dynamic chromatin organization during foregut development mediated by the organ selector gene PHA-4/FoxA. PLoS Genetics. 6 (8), (2010).
- Zhong, M., et al. Genome-wide identification of binding sites defines distinct functions for Caenorhabditis elegans PHA-4/FOXA in development and environmental response. PLoS Genetics. 6 (2), 1000848 (2010).
- Schmitz, C., Kinge, P., Hutter, H. Axon guidance genes identified in a large-scale RNAi screen using the RNAi-hypersensitive Caenorhabditis elegans strain nre-1(hd20) lin-15b(hd126). Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 104 (3), 834-839 (2007).
- Canny, J. A computational approach to edge detection. IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence. 8 (6), 679-698 (1986).
- Levin, M., Hashimshony, T., Wagner, F., Yanai, I. Developmental milestones punctuate gene expression in the Caenorhabditis embryo. Developmental Cell. 22 (5), 1101-1108 (2012).
- Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution. BioRxiv. , (2019).
- Oegema, K., Hyman, A. A. Cell division. WormBook. , 1-40 (2006).
- Insley, P., Shaham, S. Automated C. elegans embryo alignments reveal brain neuropil position invariance despite lax cell body placement. PLoS One. 13 (3), 0194861 (2018).
