Um método de imagem semi-alta-fonte e um kit de ferramentas de visualização de dados para analisar o desenvolvimento embrionário de C. elegans
Summary
Este trabalho descreve um protocolo semi-alta de supressão que permite imagens simultâneas de lapso de tempo 3D de embriaênese embrionária em embriões de 80-100 C. elegans em uma única corrida noturna. Além disso, as ferramentas de processamento e visualização de imagens são incluídas para simplificar a análise de dados. A combinação destes métodos com tensões personalizadas do repórter permite a monitoração detalhada do embryogenesis.
Abstract
C. elegans é o principal sistema para a análise sistemática da especificação do destino celular e eventos morfogenéticos durante o desenvolvimento embrionário. Um desafio é que a embriogênese se desdobra dinamicamente durante um período de cerca de 13 h; este prazo de meio dia restringiu o âmbito das experiências, limitando o número de embriões que podem ser imageados. Aqui, descrevemos um protocolo de meia-alta de supressão que permite a imagem simultânea de lapso de tempo 3D de desenvolvimento em 80-100 embriões em resolução de tempo moderado, de até 14 condições diferentes, em uma única corrida noturna. O protocolo é simples e pode ser implementado por qualquer laboratório com acesso a um microscópio com capacidade de visita de ponto. A utilidade deste protocolo é demonstrada usando-o para imagem duas cepas personalizadas expressando marcadores fluorescentes otimizados para visualizar aspectos-chave da especificação da camada germinativa e morgênese. Para analisar os dados, um programa personalizado que cultiva embriões individuais fora de um campo de visão mais amplo em todos os canais, z-passos e pontos de tempo e salva as seqüências para cada embrião em uma pilha de tiff separada foi construído. O programa, que inclui uma interface gráfica de usuário (GUI) amigável, simplifica o processamento de dados isolando, pré-processamento e orientando uniformemente embriões individuais em preparação para visualização ou análise automatizada. Também é fornecido uma macro ImageJ que compila dados de embriões individuais em um arquivo multi-painel que exibe projeção de fluorescência de intensidade máxima e imagens de campo brilhante para cada embrião em cada ponto de tempo. Os protocolos e ferramentas aqui descritos foram validados usando-os para caracterizar o desenvolvimento embrionário após a queda de 40 genes de desenvolvimento previamente descritos; esta análise visualizou fenótipos de desenvolvimento previamente anotados e revelou novos. Em resumo, este trabalho detalha um método de imagem semi-alta-desperação juntamente com um programa de corte e ferramenta de visualização ImageJ que, quando combinado com cepas expressando marcadores fluorescentes informativos, acelera muito os experimentos para analisar desenvolvimento embrionário.
Introduction
O embrião C. elegans é um importante sistema modelo para biologia celular mecanicista e análise da especificação do destino celular e eventos morfogenéticos que impulsionam o desenvolvimento embrionário1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Até o momento, grande parte da caracterização de eventos de nível celular e especificação do destino celular no embrião foi alcançada usando experimentos de imagem de resolução de imagem de resolução única (ou seja, aquisição a cada 10 a 100 s) de embriões expressando marcadores fluorescentes. Embora bem adequado para eventos na ordem de segundos a dezenas de minutos, essa abordagem torna-se tecnicamente limitante para a caracterização de processos mais longos, na ordem de horas a dias. O desenvolvimento embrionário desde a primeira clivagem até o fim do alongamento leva cerca de 10 h. Nesta escala de tempo, semi-alta-geração de métodos que permitiriam simultaneamente menor resolução de tempo de imagem (ou seja, aquisição em intervalos de tempo de 5-20 minutos) de coortes maiores de embriões, de diferentes condições, abriria uma nova gama de experimentos; por exemplo, permitindo esforços sistemáticos de triagem em larga escala e a análise de um número suficiente de embriões para comparações das consequências das perturbações moleculares.
Aqui, descrevemos um método de semi-alta-alta-entrada para monitorar c. elegans embrigenesis que permite a imagem de desenvolvimento simultânea de lapso de tempo 3D em 80-100 embriões, de até 14 condições diferentes, em uma única corrida noturna. O protocolo é simples de implementar e pode ser realizado por qualquer laboratório com acesso a um microscópio com capacidades de visita de ponto. Os principais passos deste protocolo são descritos na Figura 1. Em suma, os embriões são dissecados de adultos gravid expressando marcadores fluorescentes de interesse e transferir embriões jovens (estágio de 2-8 células) para poços de uma placa de 384 poços para imagem. Neste formato, o tamanho relativamente pequeno do poço canaliza embriões em uma área estreita, que facilite a identificação dos campos que contêm embriões múltiplos para a imagem latente do time-lapse. Para manter o desenvolvimento aproximadamente síncrono em toda a coorte de embriões, dissecções são realizadas em meios de comunicação refrigerados e a placa é mantida no gelo, o que impede o desenvolvimento significativo durante a janela de tempo de dissecação de uma hora de duração. A placa é transferida para o microscópio e embriões são filmados em uma sala com temperatura controlada durante a noite, em intervalos de tempo de 20 minutos, usando uma imersão de óleo 60x 1,35 NA lente, para coletar a gama z completa em 2 passos μm. Cinquenta campos, cada um contendo entre 1-5 embriões, são imagemdos em uma única corrida durante a noite. Dependendo do experimento desejado, a resolução de tempo pode ser aumentada (por exemplo, imagens em intervalos de 5 a 10 minutos) diminuindo proporcionalmente o número de campos de imagem.
Com este protocolo, mesmo uma única corrida noturna gera uma quantidade significativa de dados (80-100 embriões espalhados por 50 campos) e experimentos maiores podem rapidamente se tornar incontroláveis no que diz respeito à análise de dados. Para facilitar o processamento, visualização e racionalização da análise desses dados, um programa foi construído para cortar e orientar embriões e realizar etapas de pré-processamento (opcional) e uma macro ImageJ que compila os dados para simplificar a visualização. Esses programas podem ser usados para processar imagens coletadas usando abordagens convencionais, pois são independentes do método de imagem, exigindo apenas um único plano de campo brilhante. O primeiro programa leva em um campo 4D contendo vários embriões (opção GUI ou código-fonte embryoCrop.py) ou múltiplos campos 4D contendo vários embriões (screenCrop.py), planta embriões firmemente e os orienta em uma configuração anterior-posterior. Esses programas também dão aos usuários a opção de realizar subtração em segundo plano, correção de deriva e correção de atenuação. Os arquivos resultantes são uniformemente pré-processados, pilhas de tiff bem cortadas para cada embrião que são alteráveis à análise de imagem automatizada. Para tornar mais simples ver todos os embriões para cada condição, foi escrita uma macro ImageJ (OpenandCombine_embsV2.ijm), que reúne todos os embriões de uma determinada condição para uma única pilha de tiff e matrizes de imagens de campo brilhante e cor de projeção de intensidade máxima ( RGB) sobrecoloca, lado a lado, para cada embrião. Os métodos foram validados usando-os para caracterizar o desenvolvimento embrionário após a queda de 40 genes de desenvolvimento previamente descritos em um par de cepas personalizadas expressando marcadores fluorescentes otimizados para visualizar aspectos-chave da camada germinal especificação e morgênese10,11. Juntos, o protocolo de imagem embrionário semi-alta e as ferramentas de processamento de imagem permitirão experimentos de maior número amostral e esforços de triagem em larga escala destinados a entender os processos de desenvolvimento. Além disso, essas cepas também fornecerão um meio eficiente para examinar os efeitos das perturbações moleculares na embriogênese.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este trabalho descreve um conjunto de ferramentas e métodos que foram desenvolvidos para permitir esforços em maior escala para perfilar a função dos genes no desenvolvimento embrionário em C. elegans. Nosso método de meia-alta-geração permite a imagem latente 3D do time-lapse do desenvolvimento embrionário na definição de 20 minutos para 80-100 embriões em uma única experiência. Embora este protocolo possa ser adaptado para uso com qualquer cepa de marcador desejada(s), este trabalho demonstra o p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
A S.D.O. foi apoiada pelo National Institute of General Medical Sciences-sponsored University of California San Diego Institutional Research and Academic Career Development Award (NIH/IRACDA K12 GM068524). A.D. e K.O. foram apoiados pelo Instituto Ludwig de Pesquisa do Câncer, que também lhes forneceu financiamento de pesquisa usado para apoiar este trabalho. Estamos gratos a Andrew Chisholm por seu conselho nas fases iniciais deste projeto, Ronald Biggs por contribuições para este projeto após a fase inicial de desenvolvimento do método, e Dave Jenkins e Andy Shiau para apoio e acesso à Descoberta de Pequenas Moléculas sistema de imagem de alto conteúdo do grupo.
Materials
| Aspirator Tube Assembly | Drummond Scientific | 2-000-000 | |
| Calibrated Pipette (25mL) | Drummond Scientific | 2-000-025 | |
| Cell Voyager Software | Yokogawa Electric Corp | Included with CV1000 | |
| Conical Tube (15 mL ) | USA Scientific | 1475-0501 | |
| CV1000 Microscope | Yokogawa Electric Corp | CV1000 | |
| Depression slide (3-well) | Erie Scientific | 1520-006 | |
| Dissection Microscope | Nikon | SMZ-645 | |
| Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 07336 | |
| ImageJ/FIJI | Open Source | https://imagej.net/Fiji | |
| M9 Buffer | Lab Prepared | https://openwetware.org/wiki/M9_salts | |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mLl) | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Microseal F-foil Seal | Bio-Rad | MSF1001 | |
| NGM Plates | Lab Prepared | http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214 | |
| Scalpel #15 | Bard Parker | REF 371615 | |
| Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom | Greiner Bio-One | 781855 | |
| Tetramisole Hydrochloride | Sigma Aldirch | T1512-10G | |
| Tweezers, Dumont #3 | Electron Microscopy Sciences | 0109-3-PO | |
| U-PlanApo objective (10× 0.4NA) | Olympus | 1-U2B823 | |
| U-PlanApo objective (60× 1.35 NA) | Olympus | 1-U2B832 |
References
- Armenti, S. T., Nance, J. Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis. Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).
- Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. I: development, patterning, and growth. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (6), 861-878 (2012).
- Jackson, B. M., Eisenmann, D. M. beta-catenin-dependent Wnt signaling in C. elegans: teaching an old dog a new trick. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 4 (8), 007948 (2012).
- Lamkin, E. R., Heiman, M. G. Coordinated morphogenesis of neurons and glia. Current Opinion in Neurobiology. 47, 58-64 (2017).
- Loveless, T., Hardin, J. Cadherin complexity: recent insights into cadherin superfamily function in C. elegans. Current Opinion in Cell Biology. 24 (5), 695-701 (2012).
- Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , 1-16 (2005).
- Spickard, E. A., Joshi, P. M., Rothman, J. H. The multipotency-to-commitment transition in Caenorhabditis elegans-implications for reprogramming from cells to organs. FEBS Letters. 592 (6), 838-851 (2018).
- Vuong-Brender, T. T., Yang, X., Labouesse, M. C. elegans Embryonic Morphogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 116, 597-616 (2016).
- Wang, J. T., Seydoux, G. Germ cell specification. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 17-39 (2013).
- Wang, S., et al. A high-content imaging approach to profile C. elegans embryonic development. Development. 146 (7), (2019).
- Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R. N., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J. M., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A. D., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. . Dryad Digital Repository. , (2019).
- Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. . Zenodo. , (2018).
- . Software to crop C. elegans embryos from multi-channel microscopy images Available from: https://github.com/renatkh/embryo_crop (2018)
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. , 1-22 (2005).
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).
- Fakhouri, T. H., Stevenson, J., Chisholm, A. D., Mango, S. E. Dynamic chromatin organization during foregut development mediated by the organ selector gene PHA-4/FoxA. PLoS Genetics. 6 (8), (2010).
- Zhong, M., et al. Genome-wide identification of binding sites defines distinct functions for Caenorhabditis elegans PHA-4/FOXA in development and environmental response. PLoS Genetics. 6 (2), 1000848 (2010).
- Schmitz, C., Kinge, P., Hutter, H. Axon guidance genes identified in a large-scale RNAi screen using the RNAi-hypersensitive Caenorhabditis elegans strain nre-1(hd20) lin-15b(hd126). Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 104 (3), 834-839 (2007).
- Canny, J. A computational approach to edge detection. IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence. 8 (6), 679-698 (1986).
- Levin, M., Hashimshony, T., Wagner, F., Yanai, I. Developmental milestones punctuate gene expression in the Caenorhabditis embryo. Developmental Cell. 22 (5), 1101-1108 (2012).
- Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution. BioRxiv. , (2019).
- Oegema, K., Hyman, A. A. Cell division. WormBook. , 1-40 (2006).
- Insley, P., Shaham, S. Automated C. elegans embryo alignments reveal brain neuropil position invariance despite lax cell body placement. PLoS One. 13 (3), 0194861 (2018).
