שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס
Summary
עבודה זו מתארת פרוטוקול של תפוקה חצי-גבוהה המאפשרת הדמיה בו של embryogenesis בזמן בו במהירות של 80-100 ס מ עוברים בריצה אחת ללילה. בנוסף, כלי עיבוד תמונה ופריטים חזותיים נכללים כדי לייעל את ניתוח הנתונים. השילוב של שיטות אלה עם זני כתבת מותאמים אישית מאפשר ניטור מפורט של embryogenesis.
Abstract
ג. אלגיה היא המערכת המובילה לניתוח שיטתי של מפרט הגורל התא ואירועים מורפולגנטיים במהלך התפתחות עובריים. אתגר אחד הוא שembryogenesis דינמי נפרש על פני תקופה של כ -13 שעות; זה חצי ציר זמן אורך היום יש להגביל את היקף הניסויים על ידי הגבלת מספר העוברים שניתן לדימות. כאן, אנו מתארים פרוטוקול חצי-גבוה-תפוקה המאפשרת הדמיה בזמן התלת-ממד הסימולטני של פיתוח ב-80-100 עוברים ברזולוציה מתונה, מתוך עד 14 מצבים שונים, בריצה אחת ללילה. הפרוטוקול הוא פשוט יכול להיות מיושם על ידי כל מעבדה עם גישה למיקרוסקופ עם היכולת לבקר הנקודה. השירות של פרוטוקול זה מוכח על ידי שימוש בו לתמונה שני זנים בנויים אישית ביטוי סמנים פלורסנט ממוטב להמחיש היבטים מרכזיים של שכבת נבט מפרט מורפולגנזה. כדי לנתח את הנתונים, תוכנית מותאמת אישית החותכת את העוברים הבודדים משדה רחב יותר של תצוגה בכל הערוצים, z-steps ונקודות זמן ושומרת את הרצפים עבור כל עובר לתוך מחסנית tiff נפרדת. התוכנית, הכוללת ממשק משתמש גרפי ידידותי למשתמש (GUI), מפשט עיבוד נתונים על ידי בידוד, טרום עיבוד, ו בצורה אחידה עוברים בודדים לקראת ויזואליזציה או ניתוח אוטומטי. שסופקו גם היא מאקרו ImageJ המבצע הידור של נתוני העובר בודדים לתוך קובץ מרובה חלוניות המציג הקרנה בעוצמה מירבית של הקרנת הקרינה ותמונות ברייטפילד לכל עובר בכל נקודה. הפרוטוקולים והכלים המתוארים במסמך זה אומתו באמצעות השימוש בהם לאפיון התפתחות עובריים בעקבות ה40 של הגנים ההתפתחותיים שתוארו לעיל; ניתוח זה דמיינו לעיל פנוטיפים התפתחותיים וחשף חדשים. לסיכום, עבודה זו מפרטת שיטת הדמיה למחצה של תפוקה גבוהה ביחד עם תוכנית חיתוך ו-ImageJ הכלי להדמיה, כאשר בשילוב עם זנים המבטא פלורסנט אינפורמטיבי סמנים, מאיצה מאוד ניסויים לנתח פיתוח עובריים.
Introduction
העובר C. אלגיה היא מערכת חשובה מודל עבור ביולוגיה של התא מכניסטי וניתוח של מפרט הגורל תא ואירועים גנטיים מורפוליום נהיגה פיתוח עובריים1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. עד היום, רוב האפיון של האירועים ברמה התאית ואת מפרט הגורל התא בעובר הושג באמצעות ברזולוציה גבוהה יחסית הזמן ניסויים הדמיה (כלומר, רכישה כל 10-100 s) של עוברים ביטוי סמני פלורסנט. למרות שמתאים מאוד לאירועים בסדר שניות עד עשרות דקות, גישה זו הופכת להיות מגבילה מבחינה טכנית לאפיון תהליכים ארוכים יותר, בסדר שעות עד ימים. פיתוח עובריים מפני המחשוף הראשון עד סוף התארכות לוקח בערך 10 h. במהלך הזמן הזה, חצי-high-תפוקה שיטות שיאפשרו הדמיה בזמן הנמוך ביותר ברזולוציה נמוכה (כלומר, רכישה ב 5 – 20 מרווחי זמן) של כתרים גדולים יותר של עוברים, מתנאים שונים, יפתח מגוון חדש של ניסויים; לדוגמה, הפעלת מאמצי הקרנה בקנה מידה גדול וניתוח מספר מספיק של עוברים להשוואות של השלכות הרטבאליות המולקולריות.
כאן, אנו מתארים שיטה למחצה התפוקה לניטור C. אלגיה embryogenesis המאפשרת הדמיה בו בזמן תלת-ממד של התפתחות ב 80-100 עוברים, מתוך עד 14 מצבים שונים, בריצה אחת לילה. הפרוטוקול הוא פשוט ליישם והוא יכול להתבצע על ידי כל מעבדה עם גישה למיקרוסקופ עם יכולות ביקור הנקודה. השלבים העיקריים בפרוטוקול זה מתוארים באיור 1. בקצרה, עוברים גזור מבוגרים gravid המבטא סמנים פלורסנט של עניין והעברת עוברי צעירים (2 – 8 הבמה התא) כדי בארות של 384-צלחת לוח עבור הדמיה. בתבנית זו, בגודל הטוב יחסית funnels עוברים לתוך אזור צר, אשר מקלה על זיהוי של שדות המכילים עוברים מרובים עבור הדמיה בזמן מפקיעה. כדי לשמור על התפתחות סינכרונית באופן כלשהו על פני הקבוצה של העוברים, הניתוח מבוצע בתקשורת מקורר והצלחת מוחזקת על הקרח, אשר מונע התפתחות משמעותית במהלך שעת הניתוח במשך שעה. הצלחת מועברת המיקרוסקופ והעוברים מצולמים בחדר מבוקר טמפרטורה, ב 20 דקות מרווחי זמן, באמצעות שמן 60x טבילה 1.35 NA עדשה, כדי לאסוף את המלא z-טווח ב 2 יקרומטר שלבים. 50 שדות, כל אחד המכיל בין 1-5 עוברים, הם התמונה במהלך אחד לילה הפעלה. בהתאם לניסוי הרצוי, ניתן להגדיל את רזולוציית הזמן (לדוגמה, הדמיה ב-5-10 דקות) על-ידי הפחתת המספר של שדות הדמיה באופן פרופורציונלי.
עם פרוטוקול זה, אפילו הפעלת לילה אחת מייצרת כמות משמעותית של נתונים (80-100 עוברים הפרושים מעל 50 שדות) וניסויים גדולים יותר יכולים להיות במהירות ביחס לניתוח נתונים. כדי להקל על עיבוד, הדמיה חזותית וייעול הניתוח של נתונים אלה, נבנתה תוכנית לחיתוך והכנה של עוברים ולביצוע שלבי עיבוד מקדים (אופציונלי) ומאקרו ImageJ המבצע הידור של הנתונים כדי לפשט את הצפייה. ניתן להשתמש בתוכניות אלה כדי לעבד תמונות שנאספו באמצעות גישות קונבנציונליות, מאחר שהן אינן תלויות בשיטת הדימות, ודורשות רק מטוס ביביואלי יחיד. התוכנית הראשונה מקבלת בשדה 4D המכיל עוברים מרובים (אפשרות GUI או קוד מקור embryoCrop.py) או שדות 4D מרובים המכילים עוברים מרובים (screenCrop.py), גידולים הדוקים העוברים וכיוון אותם בתצורה האחורי הקדמי. תוכניות אלה גם נותנות למשתמשים אפשרות לבצע חיסור רקע, תיקון סחיפה ותיקון החליש. הקבצים המתקבלים הם אחיד מעובד מראש, חיתוך היטב בערימות tiff עבור כל עובר הamendable לניתוח תמונה אוטומטית. כדי להפוך את זה לפשוט יותר להציג את כל העוברים עבור כל תנאי, מאקרו ImageJ (OpenandCombine_embsV2. ijm) נכתב, אשר מרכיב את כל העוברים מתנאי נתון לתוך מחסנית אחת tiff ומערכים ברייטפרופילד תמונות וצבע הקרנה מקסימלית העוצמה ( RGB) כיסויי שכבות, זה לצד זה, לכל עובר. השיטות היו מאומת על ידי שימוש בהם כדי לאפיין את הפיתוח העובריים לאחר הדפיקה של 40 בעבר-תיאר גנים התפתחותיים בזוג זנים בנוי אישית המבטא סמנים פלורסנט ממוטב להמחיש היבטים מרכזיים של הנבט-שכבה מפרט ומורפוגנזה10,11. יחד עם זאת, העברת התפוקה למחצה וכלים לעיבוד התמונה מאפשרים ניסויים במספר גבוה יותר ומאמצי הקרנה בקנה מידה גדול המיועדים להבנת תהליכים התפתחותיים. בנוסף, זנים אלה יספק גם אמצעי יעיל לבדיקת ההשפעות של רטבאליות מולקולרית על embryogenesis.
Protocol
Representative Results
Discussion
עבודה זו מתארת חבילה של כלים ושיטות שפותחו כדי לאפשר מאמצים גדולים יותר לפרופיל הפונקציה של גנים בהתפתחות עובריים בג. שיטת התפוקה הגבוהה שלנו למחצה מאפשרת הדמיה של זמן תלת-ממד של התפתחות עובריים ברזולוציה של 20 דקות עבור 80 – 100 עוברים בניסוי אחד. בעוד פרוטוקול זה יכול להיות מותאם לשימו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.D.O. היה נתמך על ידי המכון הלאומי למדעי הרפואה הכללית בחסות אוניברסיטת קליפורניה בסן דייגו המחקר המוסדי ופיתוח הקריירה האקדמית פרס (NIH/IRACDA K12 GM068524). Ad ו K.O. תמכו על ידי המכון לודוויג לחקר הסרטן, אשר גם סיפק להם מימון מחקר המשמש לתמיכה זו עבודה. אנו אסירי תודה לאנדרו צ’ישולם על עצתו בשלבים המוקדמים של הפרויקט הזה, רונלד ביגס לתרומות לפרויקט זה לאחר שלב פיתוח השיטה הראשונית, ודייב ג’נקינס ואנדי Shiau לתמיכה וגישה לגילוי המולקולה הקטנה מערכת הדמיה של התוכן הגבוה של הקבוצה.
Materials
| Aspirator Tube Assembly | Drummond Scientific | 2-000-000 | |
| Calibrated Pipette (25mL) | Drummond Scientific | 2-000-025 | |
| Cell Voyager Software | Yokogawa Electric Corp | Included with CV1000 | |
| Conical Tube (15 mL ) | USA Scientific | 1475-0501 | |
| CV1000 Microscope | Yokogawa Electric Corp | CV1000 | |
| Depression slide (3-well) | Erie Scientific | 1520-006 | |
| Dissection Microscope | Nikon | SMZ-645 | |
| Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 07336 | |
| ImageJ/FIJI | Open Source | https://imagej.net/Fiji | |
| M9 Buffer | Lab Prepared | https://openwetware.org/wiki/M9_salts | |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mLl) | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Microseal F-foil Seal | Bio-Rad | MSF1001 | |
| NGM Plates | Lab Prepared | http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214 | |
| Scalpel #15 | Bard Parker | REF 371615 | |
| Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom | Greiner Bio-One | 781855 | |
| Tetramisole Hydrochloride | Sigma Aldirch | T1512-10G | |
| Tweezers, Dumont #3 | Electron Microscopy Sciences | 0109-3-PO | |
| U-PlanApo objective (10× 0.4NA) | Olympus | 1-U2B823 | |
| U-PlanApo objective (60× 1.35 NA) | Olympus | 1-U2B832 |
References
- Armenti, S. T., Nance, J. Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis. Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).
- Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. I: development, patterning, and growth. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (6), 861-878 (2012).
- Jackson, B. M., Eisenmann, D. M. beta-catenin-dependent Wnt signaling in C. elegans: teaching an old dog a new trick. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 4 (8), 007948 (2012).
- Lamkin, E. R., Heiman, M. G. Coordinated morphogenesis of neurons and glia. Current Opinion in Neurobiology. 47, 58-64 (2017).
- Loveless, T., Hardin, J. Cadherin complexity: recent insights into cadherin superfamily function in C. elegans. Current Opinion in Cell Biology. 24 (5), 695-701 (2012).
- Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , 1-16 (2005).
- Spickard, E. A., Joshi, P. M., Rothman, J. H. The multipotency-to-commitment transition in Caenorhabditis elegans-implications for reprogramming from cells to organs. FEBS Letters. 592 (6), 838-851 (2018).
- Vuong-Brender, T. T., Yang, X., Labouesse, M. C. elegans Embryonic Morphogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 116, 597-616 (2016).
- Wang, J. T., Seydoux, G. Germ cell specification. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 17-39 (2013).
- Wang, S., et al. A high-content imaging approach to profile C. elegans embryonic development. Development. 146 (7), (2019).
- Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R. N., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J. M., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A. D., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. . Dryad Digital Repository. , (2019).
- Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. . Zenodo. , (2018).
- . Software to crop C. elegans embryos from multi-channel microscopy images Available from: https://github.com/renatkh/embryo_crop (2018)
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. , 1-22 (2005).
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).
- Fakhouri, T. H., Stevenson, J., Chisholm, A. D., Mango, S. E. Dynamic chromatin organization during foregut development mediated by the organ selector gene PHA-4/FoxA. PLoS Genetics. 6 (8), (2010).
- Zhong, M., et al. Genome-wide identification of binding sites defines distinct functions for Caenorhabditis elegans PHA-4/FOXA in development and environmental response. PLoS Genetics. 6 (2), 1000848 (2010).
- Schmitz, C., Kinge, P., Hutter, H. Axon guidance genes identified in a large-scale RNAi screen using the RNAi-hypersensitive Caenorhabditis elegans strain nre-1(hd20) lin-15b(hd126). Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 104 (3), 834-839 (2007).
- Canny, J. A computational approach to edge detection. IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence. 8 (6), 679-698 (1986).
- Levin, M., Hashimshony, T., Wagner, F., Yanai, I. Developmental milestones punctuate gene expression in the Caenorhabditis embryo. Developmental Cell. 22 (5), 1101-1108 (2012).
- Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution. BioRxiv. , (2019).
- Oegema, K., Hyman, A. A. Cell division. WormBook. , 1-40 (2006).
- Insley, P., Shaham, S. Automated C. elegans embryo alignments reveal brain neuropil position invariance despite lax cell body placement. PLoS One. 13 (3), 0194861 (2018).
