Une méthode d'imagerie semi-haut débit et une boîte à outils de visualisation de données pour analyser C. elegans Embryonic Development
Summary
Ce travail décrit un protocole semi-haut débit qui permet l’imagerie simultanée en time-lapse 3D de l’embryogenèse dans 80-100 embryons d’élegans de C. dans une seule course de nuit. En outre, des outils de traitement d’image et de visualisation sont inclus pour rationaliser l’analyse des données. La combinaison de ces méthodes avec des souches de reporter personnalisées permet une surveillance détaillée de l’embryogenèse.
Abstract
C. elegans est le premier système d’analyse systématique de la spécification du destin cellulaire et des événements morphogénétiques au cours du développement embryonnaire. Un défi est que l’embryogenèse se déroule dynamiquement sur une période d’environ 13 h; cette demi-journée a limité la portée des expériences en limitant le nombre d’embryons qui peuvent être photographiés. Ici, nous décrivons un protocole semi-haut-débit qui permet l’imagerie simultanée 3D de time-lapse du développement dans 80-100 embryons à la résolution de temps modérée, de jusqu’à 14 conditions différentes, dans une seule course de nuit. Le protocole est simple et peut être mis en œuvre par n’importe quel laboratoire ayant accès à un microscope avec une capacité de visite ponctuelle. L’utilité de ce protocole est démontrée en l’utilisant pour l’image de deux souches sur mesure exprimant des marqueurs fluorescents optimisés pour visualiser les aspects clés de la spécification germinale et de la morphogénèse. Pour analyser les données, un programme personnalisé qui récolte des embryons individuels à partir d’un champ de vision plus large dans tous les canaux, z-étapes, et les points de temps et enregistre les séquences pour chaque embryon dans une pile tiff séparée a été construit. Le programme, qui comprend une interface utilisateur graphique conviviale (GUI), simplifie le traitement des données en isolant, pré-traitant et en orientant uniformément les embryons individuels en vue de la visualisation ou de l’analyse automatisée. Une macro ImageJ qui compile des données d’embryons individuelles dans un fichier multipanel qui affiche la projection de fluorescence d’intensité maximale et les images des champs lumineux pour chaque embryon à chaque moment. Les protocoles et les outils décrits ci-dessus ont été validés en les utilisant pour caractériser le développement embryonnaire après l’élimination de 40 gènes développementaux précédemment décrits ; cette analyse a visualisé les phénotypes développementaux précédemment annotés et en a révélé de nouveaux. En résumé, ce travail détaille une méthode d’imagerie semi-haut débit couplée à un programme de recadrage et à un outil de visualisation ImageJ qui, combiné à des souches exprimant des marqueurs fluorescents informatifs, accélère considérablement les expériences d’analyse développement embryonnaire.
Introduction
L’embryon de C. elegans est un système modèle important pour la biologie cellulaire mécaniste et l’analyse de la spécification du destin cellulaire et des événements morphogénétiques conduisant au développement embryonnaire1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. À ce jour, une grande partie de la caractérisation des événements au niveau cellulaire et de la spécification du destin cellulaire dans l’embryon a été réalisée à l’aide d’expériences d’imagerie ponctuelles à résolution temporelle relativement élevée (c.-à-d. acquisition tous les 10 à 100 s) d’embryons exprimant marqueurs fluorescents. Bien que bien adaptée aux événements de l’ordre de secondes à des dizaines de minutes, cette approche devient techniquement limitative pour la caractérisation de processus plus longs, de l’ordre des heures à des jours. Le développement embryonnaire du premier clivage à la fin de l’allongement prend environ 10 h. À cette échelle temporelle, des méthodes semi-à-haut débit qui permettraient l’imagerie simultanée à faible résolution temporelle (c.-à-d. l’acquisition à des intervalles de temps de 5 à 20 min) de cohortes plus importantes d’embryons, provenant de conditions différentes, ouvriraient une nouvelle gamme d’expériences; par exemple, permettre des efforts systématiques de dépistage à grande échelle et l’analyse d’un nombre suffisant d’embryons pour comparer les conséquences des perturbations moléculaires.
Ici, nous décrivons une méthode semi-haut-débit pour surveiller l’embryogenèse de C. elegans qui permet l’imagerie simultanée 3D de time-lapse du développement dans 80-100 embryons, de jusqu’à 14 conditions différentes, dans une seule course de nuit. Le protocole est simple à mettre en œuvre et peut être réalisé par n’importe quel laboratoire ayant accès à un microscope avec des capacités de visite ponctuelle. Les principales étapes de ce protocole sont décrites à la figure 1. En bref, les embryons sont disséqués à partir d’adultes gravidés exprimant des marqueurs fluorescents d’intérêt et de transférer de jeunes embryons (stade de 2 à 8 cellules) à des puits d’une plaque de 384 puits pour l’imagerie. Dans ce format, la taille relativement petite des embryons de puits entonne les embryons dans une zone étroite, ce qui facilite l’identification des champs contenant plusieurs embryons pour l’imagerie en accéléré. Pour maintenir un développement à peu près synchrone dans la cohorte d’embryons, des dissections sont effectuées dans des médias réfrigérés et la plaque est maintenue sur la glace, ce qui empêche le développement significatif pendant la fenêtre de temps de dissection d’une heure. La plaque est transférée au microscope et les embryons sont filmés dans une pièce à température contrôlée pendant la nuit, à intervalles de 20 min, à l’aide d’une lentille d’immersion d’huile de 60x 1,35 NA, pour recueillir toute la plage de Z en 2 m d’étapes. Cinquante champs, contenant chacun entre 1 et 5 embryons, sont représentés en une seule nuit. Selon l’expérience souhaitée, la résolution temporelle pourrait être augmentée (par exemple, l’imagerie à intervalles de 5 à 10 minutes) en diminuant proportionnellement le nombre de champs d’image.
Avec ce protocole, même une seule course de nuit génère une quantité importante de données (80 à 100 embryons répartis sur 50 champs) et des expériences de plus grande envergure peuvent rapidement devenir ingérables en ce qui concerne l’analyse des données. Pour faciliter le traitement, la visualisation et la rationalisation de l’analyse de ces données, un programme a été conçu pour recadrer et orienter les embryons et effectuer des étapes de prétraitement (facultatif), et une macro ImageJ qui compile les données pour simplifier la visualisation. Ces programmes peuvent être utilisés pour traiter les images recueillies à l’aide d’approches conventionnelles, car elles sont indépendantes de la méthode d’imagerie, ne nécessitant qu’un seul plan brightfield. Le premier programme prend en charge un champ 4D contenant plusieurs embryons (option GUI ou code source embryoCrop.py) ou plusieurs champs 4D contenant plusieurs embryons (screenCrop.py), cultures serrées embryons et les oriente dans une configuration antérieure-postérieure. Ces programmes donnent également aux utilisateurs la possibilité d’effectuer la soustraction de fond, la correction de dérive et la correction d’atténuation. Les fichiers qui en résultent sont des piles de tiff uniformément prétraitées et étroitement recadrées pour chaque embryon qui sont modifiables à l’analyse automatisée de l’image. Pour simplifier la vue de tous les embryons pour chaque condition, une macro ImageJ (OpenandCombine-embsV2.ijm) a été écrite, qui assemble tous les embryons d’une condition donnée dans une seule pile tiff et tableaux images brightfield et la couleur de projection d’intensité maximale ( RGB) recons, côte à côte, pour chaque embryon. Les méthodes ont été validées en les utilisant pour caractériser le développement embryonnaire après l’élimination de 40 gènes développementaux précédemment décrits dans une paire de souches sur mesure exprimant des marqueurs fluorescents optimisés pour visualiser les aspects clés de la couche germinale spécification et morphogenèse10,11. Ensemble, le protocole d’imagerie embryonnaire à semi-haut débit et les outils de traitement de l’image permettront d’expérimenter un nombre d’échantillons plus élevé et d’intensifier les efforts de dépistage à grande échelle visant à comprendre les processus de développement. En outre, ces souches fourniront également un moyen efficace d’examiner les effets des perturbations moléculaires sur l’embryogenèse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce travail décrit une série d’outils et de méthodes qui ont été développés pour permettre des efforts à plus grande échelle pour profiler la fonction des gènes dans le développement embryonnaire dans C. elegans. Notre méthode semi-haut débit permet l’imagerie en time-lapse 3D du développement embryonnaire à une résolution de 20 min pour 80 à 100 embryons dans une seule expérience. Bien que ce protocole puisse être adapté pour une utilisation avec n’importe quelle souche de marqueur souhaitée…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.D.O. a reçu le soutien du National Institute of General Medical Sciences, parrainé par l’University of California San Diego Institutional Research and Academic Career Development Award (NIH/IRACDA K12 GM068524). A.D. et K.O. ont reçu le soutien de l’Institut Ludwig pour la recherche sur le cancer, qui leur a également fourni le financement de la recherche utilisé pour soutenir ce travail. Nous sommes reconnaissants à Andrew Chisholm pour ses conseils dans les premières phases de ce projet, Ronald Biggs pour ses contributions à ce projet après la phase initiale de développement de la méthode, et Dave Jenkins et Andy Shiau pour le soutien et l’accès à la découverte de petites molécules système d’imagerie à haute teneur du groupe.
Materials
| Aspirator Tube Assembly | Drummond Scientific | 2-000-000 | |
| Calibrated Pipette (25mL) | Drummond Scientific | 2-000-025 | |
| Cell Voyager Software | Yokogawa Electric Corp | Included with CV1000 | |
| Conical Tube (15 mL ) | USA Scientific | 1475-0501 | |
| CV1000 Microscope | Yokogawa Electric Corp | CV1000 | |
| Depression slide (3-well) | Erie Scientific | 1520-006 | |
| Dissection Microscope | Nikon | SMZ-645 | |
| Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 07336 | |
| ImageJ/FIJI | Open Source | https://imagej.net/Fiji | |
| M9 Buffer | Lab Prepared | https://openwetware.org/wiki/M9_salts | |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mLl) | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Microseal F-foil Seal | Bio-Rad | MSF1001 | |
| NGM Plates | Lab Prepared | http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214 | |
| Scalpel #15 | Bard Parker | REF 371615 | |
| Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom | Greiner Bio-One | 781855 | |
| Tetramisole Hydrochloride | Sigma Aldirch | T1512-10G | |
| Tweezers, Dumont #3 | Electron Microscopy Sciences | 0109-3-PO | |
| U-PlanApo objective (10× 0.4NA) | Olympus | 1-U2B823 | |
| U-PlanApo objective (60× 1.35 NA) | Olympus | 1-U2B832 |
References
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