Een semi-High-throughput imaging methode en data visualisatie Toolkit om C. elegans embryonale ontwikkeling te analyseren
Summary
Dit werk beschrijft een semi-High-throughput protocol dat gelijktijdige 3D time-lapse beeldvorming van embryogenese in 80 – 100 C. elegans embryo’s in een enkele nachtelijke run toestaat. Daarnaast worden tools voorbeeld verwerking en visualisatie meegeleverd om de gegevensanalyse te stroomlijnen. De combinatie van deze methoden met aangepaste reporter stammen maakt gedetailleerde controle van embryogenese.
Abstract
C. elegans is het belangrijkste systeem voor de systematische analyse van de specificatie van het lot van cellen en morfogenetische gebeurtenissen tijdens de embryonale ontwikkeling. Een uitdaging is dat embryogenese dynamisch zich ontvouwt over een periode van ongeveer 13 uur; deze tijdschaal van een halve dag heeft de reikwijdte van experimenten beperkt door het aantal embryo’s dat kan worden gefotografeerd te beperken. Hier beschrijven we een semi-High-throughput-protocol dat de gelijktijdige 3D-time-lapse-beeldvorming van ontwikkeling mogelijk maakt in 80 – 100 embryo’s bij matige tijdresolutie, van maximaal 14 verschillende omstandigheden, in een enkele nachtelijke run. Het protocol is eenvoudig en kan worden geïmplementeerd door elk laboratorium met toegang tot een microscoop met punt bezoek capaciteit. Het nut van dit protocol wordt aangetoond door het te gebruiken om beeld twee op maat gebouwde stammen uitdrukken fluorescerende markers geoptimaliseerd voor het visualiseren van belangrijke aspecten van de kiem-laag specificatie en morfogenese. Om de gegevens te analyseren, is een aangepast programma dat individuele embryo’s uit een breder gezichtsveld in alle kanalen, z-stappen en tijdpunten snijdt en de sequenties voor elk embryo opslaat in een aparte TIFF-stapel gebouwd. Het programma, dat een gebruiksvriendelijke grafische gebruikersinterface (GUI) bevat, stroomlijnt de gegevensverwerking door afzonderlijke embryo’s te isoleren, vooraf te verwerken en uniform te oriënteren in voorbereiding op visualisatie of geautomatiseerde analyse. Ook meegeleverd is een ImageJ-macro die individuele embryo gegevens compileert in een bestand met meerdere panelen dat de maximale intensiteit fluorescentie projectie en brightfield-afbeeldingen voor elk embryo op elk tijdstip weergeeft. De protocollen en hulpmiddelen die hierin worden beschreven, werden gevalideerd door ze te gebruiken om embryonale ontwikkeling te karakteriseren na een knock-down van 40 eerder beschreven ontwikkelings genen; deze analyse visualiseerde eerder geannoleerde ontwikkelings fenotypes en onthulde nieuwe. Kortom, dit werk Details een semi-hoge doorvoer imaging methode in combinatie met een bijsnijden programma en ImageJ visualisatietool die, in combinatie met stammen uitdrukken informatieve fluorescerende markers, sterk versnelt experimenten te analyseren embryonale ontwikkeling.
Introduction
De C. elegans embryo is een belangrijk modelsysteem voor mechanistische celbiologie en analyse van de specificatie van het lot van cellen en morfogenetische gebeurtenissen die embryonale ontwikkeling stimuleren1,2,3,4 ,5,6,7,8,9. Tot op heden is veel van de karakterisering van zowel gebeurtenissen op cellulair niveau als de specificatie van het lot van cellen in het embryo bereikt met behulp van relatief hoge temporele resolutie One-at-a-time Imaging experimenten (d.w.z. acquisitie elke 10 – 100 s) van embryo’s die fluorescerende markers. Hoewel zeer geschikt voor gebeurtenissen op de orde van seconden tot tientallen minuten, wordt deze aanpak technisch beperkt voor de karakterisering van langere processen, op de volgorde van uren tot dagen. Embryonale ontwikkeling van het eerste decolleté tot het einde van de rek duurt ongeveer 10 uur. Op deze tijdschaal, semi-hoge doorvoer methoden die ervoor zorgen dat gelijktijdige lagere tijdresolutie Imaging (d.w.z. acquisitie met 5 – 20 min tijdsintervallen) van grotere cohorten van embryo’s, van verschillende omstandigheden, zou een nieuwe reeks experimenten openen; bijvoorbeeld het mogelijk maken van systematische grootschalige screening-inspanningen en de analyse van voldoende aantallen embryo’s voor vergelijkingen van de gevolgen van moleculaire verstoringen.
Hier beschrijven we een semi-High-throughput-methode voor het bewaken van C. elegans embryogenese die gelijktijdige 3D-timelapse-beeldvorming van de ontwikkeling mogelijk maakt in 80 – 100 embryo’s, van maximaal 14 verschillende omstandigheden, in een enkele nachtelijke run. Het protocol is eenvoudig te implementeren en kan worden uitgevoerd door elk laboratorium met toegang tot een microscoop met punt bezoek mogelijkheden. De belangrijkste stappen in dit protocol zijn uiteengezet in Figuur 1. In het kort, embryo’s worden ontleed van zwangere volwassenen uitdrukken van fluorescerende markers van belang en overdracht van jonge embryo’s (2 – 8 cel stage) naar putten van een 384-put voorbeeld vorming. In dit formaat, de relatief kleine goed grootte trechters embryo’s in een smal gebied, die de identificatie van velden met meerdere embryo’s voor time-lapse beeldvorming vergemakkelijkt. Om ruwweg synchrone ontwikkeling in de cohort van embryo’s te handhaven, worden dissecties uitgevoerd in gekoelde media en wordt de plaat op ijs gehouden, waardoor significante ontwikkeling tijdens het urenlange dissectie tijdvenster wordt voorkomen. De plaat wordt overgebracht naar de Microscoop en de embryo’s worden gefilmd in een kamer met temperatuurregeling, ‘s nachts, op 20 min tijdsintervallen, met een 60x olie onderdompeling 1,35 NA lens, om het volledige z-bereik in stappen van 2 μm te verzamelen. 50 velden, elk met een tussen 1 – 5 embryo’s, worden in één enkele nacht run afgebeeld. Afhankelijk van het gewenste experiment kan de tijdresolutie worden verhoogd (bijvoorbeeld Imaging met intervallen van 5 tot 10 minuten) door het aantal afbeeldingsvelden proportioneel te verlagen.
Met dit protocol genereert zelfs één overnight run een aanzienlijke hoeveelheid gegevens (80 – 100 embryo’s verspreid over 50 velden) en grotere experimenten kunnen snel onbeheersbaar worden met betrekking tot data-analyse. Om de verwerking, visualisatie en stroomlijn analyse van deze gegevens te vergemakkelijken, werd een programma gebouwd om embryo’s uit te snijden en te oriënteren en pre-processing stappen uit te voeren (optioneel), en een ImageJ-macro die de gegevens compileert om de weergave te vereenvoudigen. Deze Programma’s kunnen worden gebruikt om beelden te verwerken die zijn verzameld met conventionele benaderingen, omdat ze onafhankelijk zijn van de beeldvormings methode, waarbij slechts één brightfield-vlak vereist is. Het eerste programma neemt een 4D-veld met meerdere embryo’s (GUI-optie of broncode embryoCrop.py) of meerdere 4D-velden met meerdere embryo’s (screenCrop.py), snijdt embryo’s goed en oriënteert ze in een anterieure-posterieure configuratie. Deze Programma’s geven gebruikers ook de mogelijkheid om achtergrond aftrekken, drift correctie en demping correctie uit te voeren. De resulterende bestanden zijn uniform voorbewerkte, strak bijgesneden TIFF-stapels voor elk embryo dat kan worden geamendeerbaar voor geautomatiseerde beeldanalyse. Om het eenvoudiger te maken om alle embryo’s voor elke aandoening te bekijken, is een ImageJ-macro (OpenandCombine_embsV2. IJM) geschreven, die alle embryo’s van een bepaalde voorwaarde samenstelt tot één TIFF-stack en matrices van brightfield-afbeeldingen en projectie kleur voor maximale intensiteit ( RGB)-overlays, naast elkaar, voor elk embryo. De methoden werden gevalideerd door ze te gebruiken om embryonale ontwikkeling te karakteriseren na een knock-down van 40 eerder beschreven ontwikkelings genen in een paar op maat gebouwde stammen die fluorescerende markers uitdrukken die geoptimaliseerd zijn om belangrijke aspecten van kiem-laag te visualiseren specificatie en morfogenese10,11. Samen zullen de semi-hoge doorvoer embryo Imaging protocol en beeldverwerkings hulpmiddelen hogere sample-getalexperimenten en grootschalige screening-inspanningen mogelijk maken die gericht zijn op het begrijpen van ontwikkelingsprocessen. Daarnaast zullen deze stammen ook een efficiënt middel zijn om de effecten van moleculaire verstoringen op embryogenese te onderzoeken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit werk beschrijft een reeks instrumenten en methoden die zijn ontwikkeld om grotere inspanningen mogelijk te maken om de functie van genen in embryonale ontwikkeling in C. eleganste profile eren. Onze semi-High-throughput methode maakt het mogelijk om 3D-timelapse-beeldvorming van embryonale ontwikkeling met 20 minuten resolutie voor 80 – 100 embryo’s in één experiment. Hoewel dit protocol kan worden aangepast voor gebruik met elke gewenste marker stam (en), demonstreert dit werk het potentieel van de meth…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
S.D.O. werd gesteund door het National Institute of General Medical Sciences-gesponsord University of California San Diego Institutional Research en Academic Career Development Award (NIH/IRACDA K12 GM068524). A.D. en K.O. werden gesteund door het Ludwig Institute for Cancer Research, dat hen ook onderzoeksmiddelen verschafte om dit werk te ondersteunen. We zijn Andrew Chisholm dankbaar voor zijn advies in de vroege fases van dit project, Ronald Biggs voor bijdragen aan dit project na de initiële methode ontwikkelingsfase, en Dave Jenkins en Andy Shiau voor ondersteuning en toegang tot de Small molecule Discovery beeld systeem met hoge inhoud van de groep.
Materials
| Aspirator Tube Assembly | Drummond Scientific | 2-000-000 | |
| Calibrated Pipette (25mL) | Drummond Scientific | 2-000-025 | |
| Cell Voyager Software | Yokogawa Electric Corp | Included with CV1000 | |
| Conical Tube (15 mL ) | USA Scientific | 1475-0501 | |
| CV1000 Microscope | Yokogawa Electric Corp | CV1000 | |
| Depression slide (3-well) | Erie Scientific | 1520-006 | |
| Dissection Microscope | Nikon | SMZ-645 | |
| Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 07336 | |
| ImageJ/FIJI | Open Source | https://imagej.net/Fiji | |
| M9 Buffer | Lab Prepared | https://openwetware.org/wiki/M9_salts | |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mLl) | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Microseal F-foil Seal | Bio-Rad | MSF1001 | |
| NGM Plates | Lab Prepared | http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214 | |
| Scalpel #15 | Bard Parker | REF 371615 | |
| Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom | Greiner Bio-One | 781855 | |
| Tetramisole Hydrochloride | Sigma Aldirch | T1512-10G | |
| Tweezers, Dumont #3 | Electron Microscopy Sciences | 0109-3-PO | |
| U-PlanApo objective (10× 0.4NA) | Olympus | 1-U2B823 | |
| U-PlanApo objective (60× 1.35 NA) | Olympus | 1-U2B832 |
References
- Armenti, S. T., Nance, J. Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis. Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).
- Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. I: development, patterning, and growth. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (6), 861-878 (2012).
- Jackson, B. M., Eisenmann, D. M. beta-catenin-dependent Wnt signaling in C. elegans: teaching an old dog a new trick. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 4 (8), 007948 (2012).
- Lamkin, E. R., Heiman, M. G. Coordinated morphogenesis of neurons and glia. Current Opinion in Neurobiology. 47, 58-64 (2017).
- Loveless, T., Hardin, J. Cadherin complexity: recent insights into cadherin superfamily function in C. elegans. Current Opinion in Cell Biology. 24 (5), 695-701 (2012).
- Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , 1-16 (2005).
- Spickard, E. A., Joshi, P. M., Rothman, J. H. The multipotency-to-commitment transition in Caenorhabditis elegans-implications for reprogramming from cells to organs. FEBS Letters. 592 (6), 838-851 (2018).
- Vuong-Brender, T. T., Yang, X., Labouesse, M. C. elegans Embryonic Morphogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 116, 597-616 (2016).
- Wang, J. T., Seydoux, G. Germ cell specification. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 17-39 (2013).
- Wang, S., et al. A high-content imaging approach to profile C. elegans embryonic development. Development. 146 (7), (2019).
- Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R. N., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J. M., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A. D., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. . Dryad Digital Repository. , (2019).
- Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. . Zenodo. , (2018).
- . Software to crop C. elegans embryos from multi-channel microscopy images Available from: https://github.com/renatkh/embryo_crop (2018)
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. , 1-22 (2005).
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).
- Fakhouri, T. H., Stevenson, J., Chisholm, A. D., Mango, S. E. Dynamic chromatin organization during foregut development mediated by the organ selector gene PHA-4/FoxA. PLoS Genetics. 6 (8), (2010).
- Zhong, M., et al. Genome-wide identification of binding sites defines distinct functions for Caenorhabditis elegans PHA-4/FOXA in development and environmental response. PLoS Genetics. 6 (2), 1000848 (2010).
- Schmitz, C., Kinge, P., Hutter, H. Axon guidance genes identified in a large-scale RNAi screen using the RNAi-hypersensitive Caenorhabditis elegans strain nre-1(hd20) lin-15b(hd126). Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 104 (3), 834-839 (2007).
- Canny, J. A computational approach to edge detection. IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence. 8 (6), 679-698 (1986).
- Levin, M., Hashimshony, T., Wagner, F., Yanai, I. Developmental milestones punctuate gene expression in the Caenorhabditis embryo. Developmental Cell. 22 (5), 1101-1108 (2012).
- Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution. BioRxiv. , (2019).
- Oegema, K., Hyman, A. A. Cell division. WormBook. , 1-40 (2006).
- Insley, P., Shaham, S. Automated C. elegans embryo alignments reveal brain neuropil position invariance despite lax cell body placement. PLoS One. 13 (3), 0194861 (2018).
