طريقه التصوير شبه عاليه الانتاجيه ومجموعه أدوات التصور البيانات لتحليل التنمية الجنينية c. اليجس
Summary
يصف هذا العمل بروتوكولا شبه عالي الانتاجيه يسمح بالتصوير المتزامن ثلاثي الابعاد لتولد الاجنه في الاجنه من 80 إلى 100 درجه مئوية في التشغيل الليلي الواحد. بالاضافه إلى ذلك ، يتم تضمين أدوات معالجه الصور والمرئيات لتبسيط تحليل البيانات. الجمع بين هذه الأساليب مع سلالات مراسل مخصص يتيح رصد مفصل لتولد الاجنه.
Abstract
C. اليجايليس هو النظام الرئيسي للتحليل المنهجي لمواصفات مصير الخلية والاحداث الوراثية اثناء النمو الجنيني. ويتمثل أحد التحديات في ان الاجنه تتكشف ديناميكيا علي مدي فتره تبلغ حوالي 13 ساعة ؛ وقد ادي هذا المقياس الزمني الذي دام نصف يوم إلى تقييد نطاق التجارب من خلال الحد من عدد الاجنه التي يمكن ان تكون غير محدده العمر. هنا ، ونحن وصف بروتوكول شبه عاليه الانتاجيه التي تسمح للتصوير في وقت واحد 3D الفاصل الزمني للتنمية في 80-100 الاجنه في وقت معتدل القرار ، من ما يصل إلى 14 حاله مختلفه ، في الشوط الواحد بين عشيه وضحيها. البروتوكول هو واضح ويمكن تنفيذها من قبل اي مختبر مع الوصول إلى المجهر مع نقطه القدرة علي الزيارة. ويتجلى الفائدة من هذا البروتوكول باستخدامه لصوره اثنين من السلالات التي بنيت خصيصا التعبير عن علامات الفلورسنت الأمثل لتصور الجوانب الرئيسية للمواصفات الجرثومية طبقه ونشاه المستنقعات. لتحليل البيانات ، تم بناء برنامج مخصص يقوم باقتصاص الاجنه الفردية من مجال عرض أوسع في جميع القناات ، والخطوات z ، والنقاط الزمنيه ، ويحفظ المتواليات لكل جنين في كومه tiff منفصلة. وهذا البرنامج ، الذي يتضمن واجهه مستخدم رسوميه سهله الاستخدام (GUI) ، يبسط معالجه البيانات عن طريق العزل ، والمعالجة المسبقة ، وتوجيه الاجنه الفردية بشكل موحد استعدادا للتصور أو التحليل الألى. كما يتم توفير ماكرو ImageJ الذي يقوم بتجميع بيانات الجنين الفردية في ملف متعدد اللوحات يعرض الحد الأقصى من الإسقاطات الفلورية وصور الحقول الساطعة لكل جنين في كل نقطه زمنيه. تم التحقق من صحة البروتوكولات والاداات الموصوفة هنا باستخدامها لتوصيف النمو الجنيني بعد ضرب 40 الجينات التنموية الموصوفة سابقا. هذا التحليل تصور الأنماط الظاهرية التنموية المشروحة سابقا وكشفت عن أخرى جديده. وباختصار ، فان هذا العمل يفصل طريقه التصوير شبه عاليه الانتاجيه إلى جانب برنامج الاقتصاص وأداه التصور ImageJ التي ، عندما يقترن مع سلالات التعبير عن علامات الفلورسنت المعلوماتية ، يسرع إلى حد كبير التجارب لتحليل النمو الجنيني.
Introduction
الجنين c. ايلينيسس هو نظام نموذجي مهم لبيولوجيا الخلية الميكانيكية وتحليل مواصفات مصير الخلية والاحداث مورفوجينيتيك قياده التنمية الجنينية1,2,3,4 ،5،6،7،8،9. حتى الآن ، تم تحقيق الكثير من توصيف كل من الاحداث علي المستوي الخلوي ومواصفات مصير الخلية في الجنين باستخدام الاستبانة الزمنيه عاليه نسبيا تجارب التصوير الواحد في الوقت (اي اقتناء كل 10-100 ثانيه) من الاجنه التعبير عن علامات الفلورسنت. وعلي الرغم من ان هذا النهج مناسب تماما للاحداث التي تقام علي ترتيب الثواني إلى عشرات الدقائق ، فانه يصبح مقيدا من الناحية التقنية لتوصيف العمليات الأطول ، علي حسب ترتيب الساعات والأيام. التنمية الجنينية من الانقسام الأول إلى نهاية استطاله يستغرق حوالي 10 ساعة. في هذا المقياس الزمني ، والطرق شبه عاليه الانتاجيه التي من شانها ان تسمح للتصوير في وقت واحد اقل دقه التصوير (اي الاستحواذ علي فترات زمنيه 5-20 دقيقه) من المجموعات الأكبر من الاجنه ، من ظروف مختلفه ، من شانه ان يفتح نطاقا جديدا من التجارب ؛ علي سبيل المثال ، تمكين جهود الفحص المنهجي علي نطاق واسع وتحليل اعداد كافيه من الاجنه للمقارنة بين عواقب الاضطرابات الجزيئية.
هنا ، ونحن وصف طريقه شبه عاليه الانتاجيه لرصد الاجنه c. التي تمكن في وقت واحد 3d التصوير الفاصل الزمني للتنمية في 80-100 الاجنه ، من ما يصل إلى 14 حاله مختلفه ، في الشوط الواحد بين عشيه وضحيها. والبروتوكول مباشر لتنفيذه ويمكن ان يقوم به اي مختبر مع امكانيه الوصول إلى المجهر مع قدرات زيارة نقطه. وترد الخطوات الرئيسية في هذا البروتوكول في الشكل 1. وباختصار ، يتم تشريح الاجنه من البالغين الذين يعبرون عن علامات الفلورسنت المثيرة للاهتمام ونقل الاجنه الشابة (2 – 8 خلايا المرحلة) إلى الآبار من لوحه 384 البئر للتصوير. وفي هذا الشكل ، فان حجم البئر الصغير نسبيا يدخل الاجنه في منطقه ضيقه ، مما يسهل تحديد الحقول التي تحتوي علي أجنه متعددة للتصوير بالفواصل الزمنيه. للحفاظ علي التطور متزامن تقريبا عبر مجموعه من الاجنه ، يتم تنفيذ التفكيك في وسائل الاعلام المبردة ويتم عقد لوحه علي الجليد ، والذي يمنع تطورا كبيرا خلال النافذة وقت التشريح ساعة طويلة. يتم نقل لوحه إلى المجهر ويتم تصوير الاجنه في غرفه التي تسيطر عليها درجه الحرارة بين عشيه وضحيها ، في 20 فتره زمنيه دقيقه ، وذلك باستخدام 60x الغمر النفط 1.35 NA عدسه ، لجمع الكامل z-المدى في 2 ميكرومتر الخطوات. 50 الحقول التي تحتوي علي ما بين 1 إلى 5 أجنه ، والتي يتم تصويرها في الشوط الواحد بين عشيه وضحيها. اعتمادا علي التجربة المطلوبة ، يمكن زيادة دقه الوقت (علي سبيل المثال ، التصوير بفواصل زمنيه تتراوح بين 5 و 10 دقائق) من خلال تقليل عدد الحقول التي لم يتم الحد منها بشكل تناسبي.
مع هذا البروتوكول ، حتى الشوط الواحد بين عشيه وضحيها يولد كميه كبيره من البيانات (80-100 الاجنه موزعه علي 50 الحقول) والتجارب الكبيرة يمكن ان تصبح بسرعة لا يمكن السيطرة عليها فيما يتعلق بتحليل البيانات. لتسهيل المعالجة والتصور وتبسيط تحليل هذه البيانات ، تم بناء برنامج لاقتصاص وتوجيه الاجنه وتنفيذ خطوات المعالجة المسبقة (اختياري) ، وماكرو ImageJ الذي يجمع البيانات لتبسيط العرض. ويمكن استخدام هذه البرامج لمعالجه الصور التي تم جمعها باستخدام النهج التقليدية ، لأنها مستقله عن طريقه التصوير ، وتتطلب فقط طائره واحده من الحقول الساطعة. البرنامج الأول ياخذ في حقل 4D التي تحتوي علي الاجنه متعددة (GUI الخيار أو رمز المصدر embryoCrop.py) أو حقول 4D متعددة تحتوي علي الاجنه متعددة (screenCrop.py) ، والمحاصيل باحكام الاجنه ويوجه لهم في التكوين الخلفي الامامي. كما تمنح هذه البرامج المستخدمين خيار اجراء الطرح الخلفي وتصحيح الانحراف وتصحيح التوهين. الملفات الناتجة هي بشكل موحد قبل المعالجة ، مكدسات tiff اقتصاص باحكام لكل جنين التي هي قابله للتعديل إلى تحليل الصور الألى. لجعله ابسط لعرض جميع الاجنه لكل شرط ، وقد كتب ماكرو ImageJ (OpenandCombine_embsV2) ، الذي يجمع كل الاجنه من حاله معينه في كومه tiff واحده والصور والمصفوفات برايت الحقل الأقصى الإسقاط كثافة اللون ( RGB) تراكبات ، جنبا إلى جنب ، لكل جنين. تم التحقق من صحة الأساليب باستخدامها لتوصيف التنمية الجنينية بعد ضرب من 40 الجينات التنموية الموصوفة سابقا في زوج من السلالات التي بنيت خصيصا التعبير عن علامات الفلورسنت الأمثل لتصور الجوانب الرئيسية للطبقة الجرثومية مواصفة و [مورفوجنسيس]10,11. ومعا ، فان بروتوكول تصوير الاجنه شبه العالية وأداات معالجه الصور ستمكن من اجراء التجارب علي عدد أكبر من العينات وجهود الفرز الواسعة النطاق الرامية إلى فهم العمليات التنموية. الاضافه إلى ذلك ، ستوفر هذه السلالات أيضا وسيله فعاله لفحص اثار الاضطرابات الجزيئية علي الاجنه.
Protocol
Representative Results
Discussion
يصف هذا العمل مجموعه من الاداات والأساليب التي تم تطويرها لتمكين الجهود علي نطاق أوسع لتوصيف وظيفة الجينات في التنمية الجنينية في c. اليجينات. طريقتنا شبه عاليه الانتاجيه تسمح بالتصوير بالفاصل الزمني ثلاثي الابعاد للتطوير الجنيني بدقه 20 دقيقه لأجنه 80 – 100 في تجربه واحده. في حين ان هذا…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وقد تم دعم S.D.O. من قبل المعهد الوطني للعلوم الطبية العامة برعاية جامعه كاليفورنيا سان دييغو البحوث المؤسسية وجائزه التطوير الوظيفي الاكاديميه (المعاهد القومية للصحة/IRACDA K12 GM068524). وقد تم دعم كو من قبل معهد لودفيغ لأبحاث السرطان ، والذي قدم لهم أيضا تمويل الأبحاث المستخدمة لدعم هذا العمل. ونحن ممتنون لأندرو Chisholm لنصيحته في المراحل المبكرة من هذا المشروع ، رونالد بيجز للمساهمات في هذا المشروع بعد مرحله تطوير الأسلوب الاولي ، وديف جينكينس واندي Shiau للحصول علي الدعم والوصول إلى اكتشاف جزيء صغير نظام التصوير عالي المحتوي الخاص بالمجموعة.
Materials
| Aspirator Tube Assembly | Drummond Scientific | 2-000-000 | |
| Calibrated Pipette (25mL) | Drummond Scientific | 2-000-025 | |
| Cell Voyager Software | Yokogawa Electric Corp | Included with CV1000 | |
| Conical Tube (15 mL ) | USA Scientific | 1475-0501 | |
| CV1000 Microscope | Yokogawa Electric Corp | CV1000 | |
| Depression slide (3-well) | Erie Scientific | 1520-006 | |
| Dissection Microscope | Nikon | SMZ-645 | |
| Eppendorf Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 07336 | |
| ImageJ/FIJI | Open Source | https://imagej.net/Fiji | |
| M9 Buffer | Lab Prepared | https://openwetware.org/wiki/M9_salts | |
| Microcentrifuge Tube (1.5 mLl) | USA Scientific | 1615-5500 | |
| Microseal F-foil Seal | Bio-Rad | MSF1001 | |
| NGM Plates | Lab Prepared | http://www.wormbook.org/chapters/www_strainmaintain/strainmaintain.html#d0e214 | |
| Scalpel #15 | Bard Parker | REF 371615 | |
| Sensoplate Plus, 384 Well, F-bottom, Glass Bottom | Greiner Bio-One | 781855 | |
| Tetramisole Hydrochloride | Sigma Aldirch | T1512-10G | |
| Tweezers, Dumont #3 | Electron Microscopy Sciences | 0109-3-PO | |
| U-PlanApo objective (10× 0.4NA) | Olympus | 1-U2B823 | |
| U-PlanApo objective (60× 1.35 NA) | Olympus | 1-U2B832 |
References
- Armenti, S. T., Nance, J. Adherens junctions in C. elegans embryonic morphogenesis. Sub-Cellular Biochemistry. 60, 279-299 (2012).
- Chisholm, A. D., Hsiao, T. I. The Caenorhabditis elegans epidermis as a model skin. I: development, patterning, and growth. Wiley Interdisciplinary Reviews Developmental Biology. 1 (6), 861-878 (2012).
- Jackson, B. M., Eisenmann, D. M. beta-catenin-dependent Wnt signaling in C. elegans: teaching an old dog a new trick. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology. 4 (8), 007948 (2012).
- Lamkin, E. R., Heiman, M. G. Coordinated morphogenesis of neurons and glia. Current Opinion in Neurobiology. 47, 58-64 (2017).
- Loveless, T., Hardin, J. Cadherin complexity: recent insights into cadherin superfamily function in C. elegans. Current Opinion in Cell Biology. 24 (5), 695-701 (2012).
- Priess, J. R. Notch signaling in the C. elegans embryo. WormBook. , 1-16 (2005).
- Spickard, E. A., Joshi, P. M., Rothman, J. H. The multipotency-to-commitment transition in Caenorhabditis elegans-implications for reprogramming from cells to organs. FEBS Letters. 592 (6), 838-851 (2018).
- Vuong-Brender, T. T., Yang, X., Labouesse, M. C. elegans Embryonic Morphogenesis. Current Topics in Developmental Biology. 116, 597-616 (2016).
- Wang, J. T., Seydoux, G. Germ cell specification. Advances in Experimental Medicine and Biology. 757, 17-39 (2013).
- Wang, S., et al. A high-content imaging approach to profile C. elegans embryonic development. Development. 146 (7), (2019).
- Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R. N., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J. M., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A. D., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. . Dryad Digital Repository. , (2019).
- Wang, S., Ochoa, S., Khaliullin, R., Gerson-Gurwitz, A., Hendel, J., Zhao, Z., Biggs, R., Chisholm, A., Desai, A., Oegema, K., Green, R. A. . Zenodo. , (2018).
- . Software to crop C. elegans embryos from multi-channel microscopy images Available from: https://github.com/renatkh/embryo_crop (2018)
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Chisholm, A. D., Hardin, J. Epidermal morphogenesis. WormBook. , 1-22 (2005).
- Sulston, J. E., Schierenberg, E., White, J. G., Thomson, J. N. The embryonic cell lineage of the nematode Caenorhabditis elegans. Developmental Biology. 100 (1), 64-119 (1983).
- Fakhouri, T. H., Stevenson, J., Chisholm, A. D., Mango, S. E. Dynamic chromatin organization during foregut development mediated by the organ selector gene PHA-4/FoxA. PLoS Genetics. 6 (8), (2010).
- Zhong, M., et al. Genome-wide identification of binding sites defines distinct functions for Caenorhabditis elegans PHA-4/FOXA in development and environmental response. PLoS Genetics. 6 (2), 1000848 (2010).
- Schmitz, C., Kinge, P., Hutter, H. Axon guidance genes identified in a large-scale RNAi screen using the RNAi-hypersensitive Caenorhabditis elegans strain nre-1(hd20) lin-15b(hd126). Proceedings of the National Academy of Sciences, USA. 104 (3), 834-839 (2007).
- Canny, J. A computational approach to edge detection. IEEE transactions on pattern analysis and machine intelligence. 8 (6), 679-698 (1986).
- Levin, M., Hashimshony, T., Wagner, F., Yanai, I. Developmental milestones punctuate gene expression in the Caenorhabditis embryo. Developmental Cell. 22 (5), 1101-1108 (2012).
- Packer, J. S., et al. A lineage-resolved molecular atlas of C. elegans embryogenesis at single cell resolution. BioRxiv. , (2019).
- Oegema, K., Hyman, A. A. Cell division. WormBook. , 1-40 (2006).
- Insley, P., Shaham, S. Automated C. elegans embryo alignments reveal brain neuropil position invariance despite lax cell body placement. PLoS One. 13 (3), 0194861 (2018).
