Demir sınırlı Mycobacteria tarafından üretilen Ekstrasellüler Veziküllerin İzolasyon ve Karakterizasyonu
Summary
Mycobacterium tuberculosis düşük demir koşullarına yanıt olarak ekstrasellüler üretimi ve salınımını gösterir. Bu çalışma, demir eksikliğine yanıt olarak salınan mikobakteriyel ekstrasellüler saflaştırma ve karakterizasyonu için düşük demir koşulları ve yöntemleri oluşturmak için bir protokol ayrıntıları.
Abstract
Mikobakteriler, Mycobacterium tuberculosis de dahil olmak üzere (Mtb), insan tüberkülozunun nedensel ajan, doğal olarak immünolojik olarak aktif moleküller içeren ekstrasellüler veziküller (EVs) serbest. Vezikül biyogenezinin moleküler mekanizmaları, veziküllerin içeriği ve patojen-konak arabirimindeki fonksiyonları hakkında bilgi çok sınırlıdır. Bu soruların ele alınması, eVs’lerin yalıtımı, saflaştırılması ve doğrulanması için sıkı prosedürler gerektirir. Daha önce, M. tüberküloz demir kısıtlamasına maruz kaldığında vezikül üretiminin artırılmış olduğu bulunmuştur, ev sahibi ortamda Mtb’nin karşılaştığı bir durum. Burada sunulan demir eksikliği mikobakterilerden EVs izole etmek ve arındırmak için tam ve ayrıntılı bir protokoldür. Arındırılmış EVs doğrulamak için nicel ve nitel yöntemler uygulanır.
Introduction
Mikobakteriyel ekstrasellüler (MEV) membrana bağlı nano taneciklerdir, 60−300 nm boyutundadır, doğal olarak hızlı ve yavaş büyüyen mikobakteriler tarafından serbest bırakılır1. Patojenik mikobakteriler tarafından salınan MEV’ler, immünolojik olarak aktif proteinler, lipidler ve konsantre ve korunan bir şekilde salgılanan glikolipidler aracılığıyla konakla etkileşimedebilen bir mekanizma oluşturur2,3,4. MEVs karakterize etmek ve biyogenez ve işlevlerini anlamak için, vezikül arınma ve doğrulama sıkı ve verimli yöntemler çok önemlidir. Şimdiye kadar, MEVs bir demir açısından zengin orta1,5,6,7,8yetiştirilen mikobakterilerin kültür filtrates izole edilmiştir.
Ancak, önceki çalışma demir sınırlama büyük ölçüde Mtb vezikül salınımını uyarır gösterdi, muhtemelen mycobactin üzerinden demir yakalamak için, MEVs salgılanan bir siderophore9. Yüksek demir ortamda yetiştirilen Mtb’lerden MEV izolasyonu prosedürleri tanımlanmış olsa da, düşük demir kültürlerinden MEV elde etmek için etkili bir metodoloji bildirilmemiştir. Bu nedenle, bu yöntemin amacı, biyokimyasal ve fonksiyonel tahliller ve mikobakterilerde vezikül üretiminin genetik belirleyicilerinin analizi için kullanılabilmesi için düşük demir kültürlerinden elde edilen MEV’leri izole etmek, arındırmak ve ölçmektir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ökaryotik hücre kaynaklı ekzozomları arındırmak için birden fazla yöntem geliştirilmiştir12. Buna karşılık, bakteri kaynaklı EVs7arındırmak için etkili yöntemler hakkında sınırlı bilgi vardır. Mtb kaynaklı EV’lerin verimli bir şekilde izole edilmesi, bu patojenik mikobacterium’un yetiştirimindeki içsel zorlukları göz önünde bulundurmak gerekir. Mtb uzun bir bölünme süresine sahiptir (~24 saat) ve biyogüvenlik seviyesi üç (BSL-3) koşulla…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Rafael Prados-Rosales’e nanopartikül izleme analizi ni gerçekleştiren anti-MEV antisera ve Navneet Dogra’yı paylaştığı için minnettarız.
Materials
| Amicon stirred cell Model 108 | EMD Milipore | UFSC40001 | Cell Ultrafiltration system |
| BD Polypropilene 225 ml conical tubes | Fisher | 05-538-61 | Conical centrifuge tubes |
| Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane | EMD Milipore | PBHK07610 | Ultrafiltration membrane |
| Chelex-100 resin | Bio-Rad | 142-2842 | Metal chelating resin |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD Difco | 262710 | Mycobacterial Agar plates |
| Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | Mycobacterial broth medium |
| Nitro cellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600001 | Blotting Membrane |
| Optiprep | Sigma | D1556 | Iodixanol |
| Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm |
| Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm | Beckman Coulter | 344059 | Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm |
| Protein Assay dye | BioRad | 5000006 | Bradford Protein Staining |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S12000 | Ultrasensitive protein stain |
| TMA-DPH | Molecular Probes | T204 | 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate |
| Vacuum filtration flasks | CellPro | V50022 | Filter Unit |
References
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).
- Gupta, S., Rodriguez, G. M. Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions. Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).
- Athman, J. J., et al. Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages. Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).
- Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).
- Rath, P., et al. Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).
- White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity. mBio. 9, pii 00778 (2018).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731 (2017).
- Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
- Prados-Rosales, R., et al. Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion. Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).
- Sanders, E. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).
- Harlow, E., Lane, L. . Antibodies. A laboratory manual. , (1988).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
