Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares producidas por micobacterias limitadas por hierro
Summary
Mycobacterium tuberculosis muestra un aumento de la producción y liberación de vesículas extracelulares en respuesta a condiciones bajas de hierro. Este trabajo detalla un protocolo para generar condiciones de hierro bajas y métodos para la purificación y caracterización de vesículas extracelulares micobacterianas liberadas en respuesta a la deficiencia de hierro.
Abstract
Las micobacterias, incluyendo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), el agente causante de la tuberculosis humana, liberan naturalmente vesículas extracelulares (EV) que contienen moléculas inmunológicamente activas. El conocimiento sobre los mecanismos moleculares de la biogénesis vesícula, el contenido de las vesículas y sus funciones en la interfaz patógeno-huésped es muy limitado. Abordar estas preguntas requiere procedimientos rigurosos para el aislamiento, purificación y validación de vehículos eléctricos. Anteriormente, se encontró que la producción de vesículas se mejoró cuando M. tuberculosis estaba expuesta a una restricción de hierro, una condición encontrada por Mtb en el entorno huésped. Aquí se presenta un protocolo completo y detallado para aislar y purificar los vehículos eléctricos de las micobacterias con deficiencia de hierro. Se aplican métodos cuantitativos y cualitativos para validar los vehículos eléctricos purificados.
Introduction
Las vesículas extracelulares micobacterianas (MEV) son nanopartículas unidas a la membrana, de 60 a 300 nm de tamaño, liberadas naturalmente por micobacterias de crecimiento rápido y lento1. Los MEV liberados por micobacterias patógenas constituyen un mecanismo para interactuar con el huésped a través de proteínas inmunológicamente activas, lípidos y glucólidos secretados de manera concentrada y protegida2,3,4. Para caracterizar MEVs y comprender su biogénesis y funciones, son cruciales métodos estrictos y eficientes de purificación y validación de vesículas. Hasta ahora, los MEV se han aislado de los filtrados de cultivo de micobacterias cultivadas en un medio rico en hierro1,5,6,7,8.
Sin embargo, trabajos anteriores demostraron que la limitación del hierro estimula en gran medida la liberación de vesículas en Mtb, posiblemente para capturar hierro a través de mycobactin, un siderophore secretado en MEVs9. Aunque se han descrito procedimientos para el aislamiento de MEV de Mtb cultivadoen en medios de hierro alto, no se ha informado de una metodología eficiente para obtener MEV de cultivos de hierro bajos. Por lo tanto, el objetivo de este método es aislar, purificar y cuantificar los MEV obtenidos de cultivos de hierro bajos para que puedan ser utilizados para ensayos bioquímicos y funcionales y para el análisis de determinantes genéticos de la producción de vesículas en micobacterias.
Protocol
Representative Results
Discussion
Múltiples métodos para purificar exosomas derivados de células eucariotas se han desarrollado12. Por el contrario, hay información limitada sobre métodos eficaces para purificar los vehículos eléctricos derivados de bacterias7. El aislamiento eficiente de los vehículos eléctricos derivados de Mtb debe tener en cuenta las dificultades intrínsecas en el crecimiento de esta micobacterium patógena. Mtb tiene un largo tiempo de división (24 h) y debe manejarse en con…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Rafael Prados-Rosales por compartir el antisera anti-MEV y Navneet Dogra por realizar análisis de seguimiento de nanopartículas.
Materials
| Amicon stirred cell Model 108 | EMD Milipore | UFSC40001 | Cell Ultrafiltration system |
| BD Polypropilene 225 ml conical tubes | Fisher | 05-538-61 | Conical centrifuge tubes |
| Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane | EMD Milipore | PBHK07610 | Ultrafiltration membrane |
| Chelex-100 resin | Bio-Rad | 142-2842 | Metal chelating resin |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD Difco | 262710 | Mycobacterial Agar plates |
| Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | Mycobacterial broth medium |
| Nitro cellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600001 | Blotting Membrane |
| Optiprep | Sigma | D1556 | Iodixanol |
| Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm |
| Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm | Beckman Coulter | 344059 | Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm |
| Protein Assay dye | BioRad | 5000006 | Bradford Protein Staining |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S12000 | Ultrasensitive protein stain |
| TMA-DPH | Molecular Probes | T204 | 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate |
| Vacuum filtration flasks | CellPro | V50022 | Filter Unit |
References
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