Изоляция и характеристика внеклеточных пузырьков, производимых железо-ограниченным имикобактериями
Summary
Микобактерия туберкулеза показывает увеличение производства и высвобождение внеклеточных пузырьков в ответ на низкие железные условия. Эта работа детали протокола для генерации низких железных условий и методов для очистки и характеристики микобактериальных внеклеточных пузырьков, выпущенных в ответ на дефицит железа.
Abstract
Микобактерии, в том числе Микобактерии туберкулеза (МТБ), возбудителя туберкулеза человека, естественным образом высвобождают внеклеточные пузырьки (ЭВ), содержащие иммунологически активные молекулы. Знания о молекулярных механизмах везиклового биогенеза, содержании пузырьков и их функциях при патогенно-хост-интерфейсе очень ограничены. Решение этих вопросов требует строгих процедур для изоляции, очистки и проверки EVs. Ранее было установлено, что производство везикл было увеличено, когда М. туберкулез подвергался воздействию ограничения железа, состояние, с которым сталкивается Mtb в принимающей среде. Представлен полный и подробный протокол для изоляции и очистки EVs от железодефицитных микобактерий. Количественные и качественные методы применяются для проверки очищенных ЭВ.
Introduction
Микобактериальные внеклеточные пузырьки (MEV) являются мембранными наночастицами, размером 60-300 нм, естественно выделяемых быстро- и медленно растущими микобактериями1. МЕВ, высвобождаемые патогенными микобактериями, представляют собой механизм взаимодействия с хозяином с помощью иммунологически активных белков, липидов и гликолипидов, выделяемых концентрированным и защищенным образом2,3,4. Для характеристики МЭВ и понимания их биогенеза и функций, строгие и эффективные методы очистки везикулы и проверки имеют решающее значение. До сих пор, MEVs были изолированы от культуры фильтратов микобактерий, выращенных в богатых железом среде1,5,6,7,8.
Тем не менее, предыдущая работа показала, что ограничение железа значительно стимулирует высвобождение везикля в Mtb, возможно, для захвата железа с помощью микобактина, siderophore выделяется в MEVs9. Хотя процедуры изоляции МЭВ от Mtb, культивированные в высокой железной среде, были описаны, эффективной методологии получения МЭВ из низкой культуры железа не сообщалось. Таким образом, цель этого метода состоит в том, чтобы изолировать, очистить и количественно MEVs, полученные из низких культур железа, так что они могут быть использованы для биохимических и функциональных анализов и для анализа генетических детерминантов везиклов производства в микобактериях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Несколько методов для очистки эукариотических клеток, полученных экзосомы были разработаны12. В отличие от этого, существует ограниченная информация об эффективных методах очистки бактерий полученных EVs7. Эффективная изоляция Mtb-полученных EVs необходимо учиты…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарны Рафаэлю Прадос-Росалесу за то, что он поделился антисерой антисеры МИВ и Навнитом Догра за выполнение анализа отслеживания наночастиц.
Materials
| Amicon stirred cell Model 108 | EMD Milipore | UFSC40001 | Cell Ultrafiltration system |
| BD Polypropilene 225 ml conical tubes | Fisher | 05-538-61 | Conical centrifuge tubes |
| Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane | EMD Milipore | PBHK07610 | Ultrafiltration membrane |
| Chelex-100 resin | Bio-Rad | 142-2842 | Metal chelating resin |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD Difco | 262710 | Mycobacterial Agar plates |
| Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | Mycobacterial broth medium |
| Nitro cellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600001 | Blotting Membrane |
| Optiprep | Sigma | D1556 | Iodixanol |
| Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm |
| Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm | Beckman Coulter | 344059 | Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm |
| Protein Assay dye | BioRad | 5000006 | Bradford Protein Staining |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S12000 | Ultrasensitive protein stain |
| TMA-DPH | Molecular Probes | T204 | 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate |
| Vacuum filtration flasks | CellPro | V50022 | Filter Unit |
References
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).
- Gupta, S., Rodriguez, G. M. Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions. Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).
- Athman, J. J., et al. Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages. Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).
- Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).
- Rath, P., et al. Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).
- White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity. mBio. 9, pii 00778 (2018).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731 (2017).
- Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
- Prados-Rosales, R., et al. Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion. Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).
- Sanders, E. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).
- Harlow, E., Lane, L. . Antibodies. A laboratory manual. , (1988).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
