Isolamento e caracterização de vesículas extracelulares produzidas por micobactérias limitadas por ferro
Summary
Mycobacterium tuberculosis mostra aumento da produção e liberação de vesículas extracelulares em resposta às condições de baixo ferro. Este trabalho detalha um protocolo para gerar condições e métodos baixos de ferro para a purificação e caracterização de vesículas extracelulares micobacterianas liberadas em resposta à deficiência de ferro.
Abstract
Micobactérias, incluindo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), o agente causador da tuberculose humana, liberam naturalmente vesículas extracelulares (EVs) contendo moléculas imunologicamente ativas. O conhecimento sobre os mecanismos moleculares da biogênese vesícula, o conteúdo das vesículas e suas funções na interface patógeno-hospedeiro é muito limitado. Abordar essas questões requer procedimentos rigorosos para isolamento, purificação e validação de EVs. Previamente, a produção do vesicle foi encontrada para ser realçada quando a tuberculose de M. foi expor à limitação do ferro, uma circunstância encontrada por Mtb no ambiente do anfitrião. Apresentado aqui é um protocolo completo e detalhado para isolar e purificar EVs de micobactérias deficientes em ferro. Métodos quantitativos e qualitativos são aplicados para validar EVs purificados.
Introduction
As vesículas extracelulares micobacterianas (MEVs) são nanopartículas ligadas à membrana, de 60 a 300 nm de tamanho, naturalmente liberadas por micobactérias de crescimento rápido e lento1. Mevs liberados por micobactérias patogênicas constituem um mecanismo para interagir com o hospedeiro através de proteínas imunologicamente ativas, lipídios e glicolipides secretados de forma concentrada e protegida2,3,4. Para caracterizar MEVs e compreender a sua biogênese e funções, métodos rigorosos e eficientes de purificação e validação de vesículas são cruciais. Até agora, mevs foram isolados da cultura filtrates de micobactérias cultivadas em um meio rico em ferro1,5,6,7,8.
No entanto, trabalhos anteriores demonstraram que a limitação de ferro estimula muito a liberação de vesículas em Mtb, possivelmente para capturar ferro via micobactina, um sideróforo secretado em MEVs9. Embora os procedimentos para o isolamento de MEVs de Mtb cultivados em médio de alto ferro tenham sido descritos, uma metodologia eficiente para obter MEVs de culturas de baixo ferro não foi relatada. Portanto, o objetivo deste método é isolar, purificar e quantificar os MEVs obtidos de culturas de baixo ferro para que possam ser usados para ensaios bioquímicos e funcionais e para a análise de determinantes genéticos da produção de vesículas em micobactérias.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vários métodos para purificar exossomos derivados de células eucarióticas foram desenvolvidos12. Em contraste, há informações limitadas sobre métodos eficazes para purificar EVs derivados de bactérias7. O isolamento eficiente dos EVs derivados de Mtb precisa considerar as dificuldades intrínsecas no crescimento dessa micobactéria patogênica. Mtb tem um longo tempo de divisão (~ 24 h) e deve ser tratado em condições de nível de biossegurança três (BSL-3). P…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Somos gratos a Rafael Prados-Rosales por compartilhar o anti-MEV antisera e Navneet Dogra para a realização de análise de rastreamento de nanopartículas.
Materials
| Amicon stirred cell Model 108 | EMD Milipore | UFSC40001 | Cell Ultrafiltration system |
| BD Polypropilene 225 ml conical tubes | Fisher | 05-538-61 | Conical centrifuge tubes |
| Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane | EMD Milipore | PBHK07610 | Ultrafiltration membrane |
| Chelex-100 resin | Bio-Rad | 142-2842 | Metal chelating resin |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD Difco | 262710 | Mycobacterial Agar plates |
| Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | Mycobacterial broth medium |
| Nitro cellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600001 | Blotting Membrane |
| Optiprep | Sigma | D1556 | Iodixanol |
| Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm |
| Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm | Beckman Coulter | 344059 | Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm |
| Protein Assay dye | BioRad | 5000006 | Bradford Protein Staining |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S12000 | Ultrasensitive protein stain |
| TMA-DPH | Molecular Probes | T204 | 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate |
| Vacuum filtration flasks | CellPro | V50022 | Filter Unit |
References
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).
- Gupta, S., Rodriguez, G. M. Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions. Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).
- Athman, J. J., et al. Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages. Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).
- Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).
- Rath, P., et al. Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).
- White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity. mBio. 9, pii 00778 (2018).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731 (2017).
- Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
- Prados-Rosales, R., et al. Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion. Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).
- Sanders, E. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).
- Harlow, E., Lane, L. . Antibodies. A laboratory manual. , (1988).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
