שחפת של פטרת מראה הפקה מוגברת ושחרור של ושלפוחיות של מסחטות בתגובה לתנאי ברזל נמוך. עבודה זו מפרטת פרוטוקול ליצירת תנאי ברזל נמוך ושיטות לטיהור ואפיון של שלפוחיות ומסחטות בקטריאליים שפורסמו בתגובה למחסור בברזל.
בקטריה, כולל שחפת של פטרת (Mtb), הסוכן סיבתי של שחפת האדם, שחרור באופן טבעי ושלפוחיות (EVs) המכיל מולקולות פעילות חיסונית. ידע בנוגע למנגנון המולקולרי של שלפוחית הביוגנזה, התוכן של שלפוחיות, והתפקודים שלהם בממשק מארח הפתוגן הוא מאוד מוגבל. טיפול בשאלות אלה דורש הליכים קפדניים לבידוד, טיהור ואימות של EVs. בעבר, הפקת שלפוחית הייצור היתה משופרת כאשר M. שחפת נחשף הגבלה ברזל, מצב שנתקל Mtb בסביבה המארחת. מוצג כאן הוא פרוטוקול מלא ומפורט כדי לבודד ולטהר EVs מן הברזל מלקוי של ברזל. שיטות כמותיים ואיכותניות מוחלות על אימות EVs מטוהרים.
מסחטות של פטרת שלפוחיות (MEVs) הם חלקיקים מאוגדים קרום, 60-300 ננומטר בגודל, באופן טבעי שוחרר על ידי מהיר-ו-לאט גדל בקטריה מפטרת1. Mevs שוחרר על ידי חיידקים פתוגניים מהווים מנגנון לאינטראקציה עם המארח באמצעות חלבונים פעילים חיסוני, שומנים, ו גליקולפידים מופרש באופן מרוכז ומוגן2,3,4. כדי לאפיין MEVs ולהבין הביוגנזה שלהם פונקציות, שיטות קפדניות ויעילות של שלפוחית השמש והאימות הם קריטיים. עד כה, mevs מבודדים מן filtrates תרבות של פטרת גדל בינוני עשיר ברזל1,5,6,7,8.
עם זאת, העבודה הקודמת הוכיחה כי מגבלת ברזל מעוררת במידה רבה שחרור שלפוחית ב Mtb, אולי כדי ללכוד ברזל דרך פטרת, siderophore מופרש MEVs9. למרות ההליכים עבור MEVs בידוד מ Mtb תרבותי בינוני ברזל גבוה תוארו, מתודולוגיה יעילה להשיג MEVs מתרבויות ברזל נמוך לא דווחו. לכן, המטרה של שיטה זו היא לבודד, לטהר, ולכמת mevs שהתקבלו מתרבויות ברזל נמוך, כך שהם יכולים לשמש עבור בחני הביוכימי ופונקציונלי לניתוח של דטרמיניזם גנטי של ייצור שלפוחית לפוחית ב בקטריה.
שיטות מרובות כדי לטהר תא איקריוטית הנגזרות המפותחות התפתחו12. לעומת זאת, יש מידע מוגבל על שיטות יעילות כדי לטהר חיידקים נגזר EVs7. בידוד יעיל של Mtb נגזר EVs צריך לשקול את הקשיים הפנימיים בגידול זה פטרת הפתוגני. Mtb יש זמן חלוקה ארוכה (~ 24 שעות) ויש לטפל ברמת בטיחות שלושה (BSL…
The authors have nothing to disclose.
אנחנו אסירי תודה לרפאל prados-rosales עבור שיתוף anti-mev קטריולוגיה ו navneet dogra לביצוע ניתוח מעקב ננו-חלקיק.
Amicon stirred cell Model 108 | EMD Milipore | UFSC40001 | Cell Ultrafiltration system |
BD Polypropilene 225 ml conical tubes | Fisher | 05-538-61 | Conical centrifuge tubes |
Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane | EMD Milipore | PBHK07610 | Ultrafiltration membrane |
Chelex-100 resin | Bio-Rad | 142-2842 | Metal chelating resin |
Middlebrook 7H10 Agar | BD Difco | 262710 | Mycobacterial Agar plates |
Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | Mycobacterial broth medium |
Nitro cellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600001 | Blotting Membrane |
Optiprep | Sigma | D1556 | Iodixanol |
Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm |
Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm | Beckman Coulter | 344059 | Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm |
Protein Assay dye | BioRad | 5000006 | Bradford Protein Staining |
SYPRO Ruby | Molecular Probes | S12000 | Ultrasensitive protein stain |
TMA-DPH | Molecular Probes | T204 | 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate |
Vacuum filtration flasks | CellPro | V50022 | Filter Unit |