Isolierung und Charakterisierung von extrazellulären Vesikeln, die von eisenbegrenzten Mykobakterien hergestellt werden
Summary
Mycobacterium tuberculosis zeigt eine erhöhte Produktion und Freisetzung von extrazellulären Vesikeln als Reaktion auf niedrige Eisenbedingungen. Diese Arbeit beschreibt ein Protokoll zur Erzeugung niedriger Eisenbedingungen und Methoden zur Reinigung und Charakterisierung mykobakterieller extrazellulärer Vesikel, die als Reaktion auf Eisenmangel freigesetzt werden.
Abstract
Mykobakterien, einschließlich Mycobacterium tuberculosis (Mtb), dem Erreger der menschlichen Tuberkulose, setzen natürlich extrazelluläre Vesikel (EVs) frei, die immunologisch aktive Moleküle enthalten. Das Wissen über die molekularen Mechanismen der Vesikelbiogenese, den Gehalt der Vesikel und ihre Funktionen an der Pathogen-Host-Schnittstelle ist sehr begrenzt. Um diese Fragen zu lösen, sind strenge Verfahren für die Isolierung, Reinigung und Validierung von Elektrofahrzeugen erforderlich. Zuvor wurde festgestellt, dass die Vesikelproduktion verbessert wurde, wenn M. tuberculosis einer Eisenbeschränkung ausgesetzt war, ein Zustand, dem Mtb in der Wirtsumgebung begegnete. Hier wird ein vollständiges und detailliertes Protokoll zur Isolierung und Reinigung von Elektrofahrzeugen von eisenmangeligen Mykobakterien vorgestellt. Quantitative und qualitative Methoden werden angewendet, um gereinigte Elektrofahrzeuge zu validieren.
Introduction
Mykobakterielle extrazelluläre Vesikel (MEVs) sind membrangebundene Nanopartikel mit einer Größe von 60 bis 300 nm, die natürlicherweise von schnell- und langsam wachsenden Mykobakterien freigesetzt werden1. MEVs, die von pathogenen Mykobakterien freigesetzt werden, bilden einen Mechanismus, um mit dem Wirt über immunologisch aktive Proteine, Lipide und Glykolipide zu interagieren, die konzentriert und geschützt abgesondert werden2,3,4. Um MEVs zu charakterisieren und ihre Biogenese und Funktionen zu verstehen, sind strenge und effiziente Methoden der Vesikelreinigung und -validierung von entscheidender Bedeutung. Bisher wurden MEVs aus den Kulturfiltraten von Mykobakterien isoliert, die in einem eisenreichenMedium1,5,6,7,8angebaut wurden.
Frühere Arbeiten zeigten jedoch, dass die Eisenbegrenzung die Freisetzung von Vesikel in Mtb stark stimuliert, möglicherweise um Eisen über Mycobactin zu fangen, ein Siderophor, das in MEVs9abgesondert wird. Obwohl Verfahren für die Isolierung von MEVs von Mtb, die in eisenhohem Medium kultiviert wurden, beschrieben wurden, wurde keine effiziente Methode zur Gewinnung von MEVs aus eisenarmen Kulturen beschrieben. Daher ist das Ziel dieser Methode, MEVs aus niedrigen Eisenkulturen zu isolieren, zu reinigen und zu quantifizieren, so dass sie für biochemische und funktionelle Tests und für die Analyse genetischer Determinanten der Vesikelproduktion in Mykobakterien verwendet werden können.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mehrere Methoden zur Reinigung von eukaryotischen Zell-abgeleiteten Exosomen wurden entwickelt12. Im Gegensatz dazu gibt es nur begrenzte Informationen über wirksame Methoden zur Reinigung von bakteriellen EVs7. Effiziente Isolierung von Mtb-abgeleiteten Elektrofahrzeugen muss die intrinsischen Schwierigkeiten beim Anbau dieses pathogenen Mycobacteriums berücksichtigen. Mtb hat eine lange Teilungszeit (24 h) und sollte unter Biosicherheitsstufe drei (BSL-3) Bedingungen be…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken Rafael Prados-Rosales für die gemeinsame Nutzung der Anti-MEV-Antisera und Navneet Dogra für die Durchführung von Nanopartikel-Tracking-Analysen.
Materials
| Amicon stirred cell Model 108 | EMD Milipore | UFSC40001 | Cell Ultrafiltration system |
| BD Polypropilene 225 ml conical tubes | Fisher | 05-538-61 | Conical centrifuge tubes |
| Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane | EMD Milipore | PBHK07610 | Ultrafiltration membrane |
| Chelex-100 resin | Bio-Rad | 142-2842 | Metal chelating resin |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD Difco | 262710 | Mycobacterial Agar plates |
| Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | Mycobacterial broth medium |
| Nitro cellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600001 | Blotting Membrane |
| Optiprep | Sigma | D1556 | Iodixanol |
| Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm |
| Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm | Beckman Coulter | 344059 | Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm |
| Protein Assay dye | BioRad | 5000006 | Bradford Protein Staining |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S12000 | Ultrasensitive protein stain |
| TMA-DPH | Molecular Probes | T204 | 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate |
| Vacuum filtration flasks | CellPro | V50022 | Filter Unit |
References
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