Isolatie en karakterisering van extracellulaire vesicles geproduceerd door ijzer-beperkte mycobacteriën
Summary
Mycobacterium tuberculose vertoont een verhoogde productie en afgifte van extracellulaire blaasjes als reactie op lage ijzer omstandigheden. Dit werk Details een protocol voor het genereren van lage ijzer omstandigheden en methoden voor de zuivering en karakterisering van mycobacteriële extracellulaire blaasjes vrijgegeven in reactie op ijzertekort.
Abstract
Mycobacteriën, waaronder Mycobacterium tuberculose (MTB), de veroorzaker van humane tuberculose, brengen natuurlijke extracellulaire blaasjes (ev’s) met immunologisch actieve moleculen vrij. Kennis over de moleculaire mechanismen van blaasje biogenese, de inhoud van de blaasjes, en hun functies op de pathogeen-hostinterface is zeer beperkt. Het aanpakken van deze vragen vergt strenge procedures voor isolatie, zuivering en validering van Ev’s. Eerder bleek de productie van blaasje te worden verbeterd toen M. tuberculose werd blootgesteld aan ijzer beperking, een aandoening die door MTB in de hostomgeving wordt ondervonden. Hier gepresenteerd is een compleet en gedetailleerd protocol om Ev’s te isoleren en te zuiveren van ijzer deficiënte mycobacteriën. Er worden kwantitatieve en kwalitatieve methoden toegepast om gezuiverde Ev’s te valideren.
Introduction
Mycobacteriële extracellulaire blaasjes (mev’s) zijn membraan gebonden nanodeeltjes, 60 − 300 nm in grootte, natuurlijk vrijgegeven door snel-en langzaam groeiende mycobacteriën1. Mev’s vrijgegeven door pathogene mycobacteriën vormen een mechanisme om te communiceren met de gastheer via immunologisch actieve eiwitten, lipiden, en glycolipiden uitgescheiden in een geconcentreerde en beschermde manier2,3,4. Om mevs te karakteriseren en hun biogenese en functies te begrijpen, zijn strikte en efficiënte methoden voor het zuiveren en valideren van blaasje cruciaal. Tot nu toe zijn mev’s geïsoleerd van de cultuur filtraten van mycobacteriën geteeld in een ijzerrijke medium1,5,6,7,8.
Echter, vorig werk toonde aan dat ijzer beperking sterk stimuleert blaasje vrijlating in MTB, mogelijk om ijzer vast te leggen via mycobactin, een siderophore uitgescheiden in mevs9. Hoewel er een beschrijving is gegeven van de procedures voor Mev’s die geïsoleerd zijn van MTB-culturen in een hoog ijzer medium, is er geen efficiënte methodologie gerapporteerd voor het verkrijgen van Mev’s uit een laag ijzergehalte. Daarom is het doel van deze methode het isoleren, zuiveren en kwantificeren van mev’s die zijn verkregen uit lage ijzer culturen, zodat ze kunnen worden gebruikt voor biochemische en functionele testen en voor de analyse van genetische determinanten van blaasje productie in mycobacteriën.
Protocol
Representative Results
Discussion
Er zijn meerdere methoden ontwikkeld voor het zuiveren van eukaryote celafgeleide exosomen12. Er is daarentegen beperkte informatie beschikbaar over effectieve methoden voor het zuiveren van door bacteriën afgeleide Ev’s7. Efficiënte isolatie van Ev’s met MTB-derivaten moet rekening houden met de intrinsieke moeilijkheden bij het kweken van deze pathogene Mycobacterium. MTB heeft een lange delings tijd (~ 24 uur) en moet worden behandeld in de bioveiligheid niveau drie (B…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We zijn Rafael Prados-Rosales dankbaar voor het delen van de anti-MeV antisera en Navneet Dogra voor het uitvoeren van nanodeeltjes Tracking Analysis.
Materials
| Amicon stirred cell Model 108 | EMD Milipore | UFSC40001 | Cell Ultrafiltration system |
| BD Polypropilene 225 ml conical tubes | Fisher | 05-538-61 | Conical centrifuge tubes |
| Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane | EMD Milipore | PBHK07610 | Ultrafiltration membrane |
| Chelex-100 resin | Bio-Rad | 142-2842 | Metal chelating resin |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD Difco | 262710 | Mycobacterial Agar plates |
| Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | Mycobacterial broth medium |
| Nitro cellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600001 | Blotting Membrane |
| Optiprep | Sigma | D1556 | Iodixanol |
| Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm |
| Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm | Beckman Coulter | 344059 | Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm |
| Protein Assay dye | BioRad | 5000006 | Bradford Protein Staining |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S12000 | Ultrasensitive protein stain |
| TMA-DPH | Molecular Probes | T204 | 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate |
| Vacuum filtration flasks | CellPro | V50022 | Filter Unit |
References
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).
- Gupta, S., Rodriguez, G. M. Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions. Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).
- Athman, J. J., et al. Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages. Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).
- Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).
- Rath, P., et al. Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).
- White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity. mBio. 9, pii 00778 (2018).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731 (2017).
- Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
- Prados-Rosales, R., et al. Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion. Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).
- Sanders, E. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).
- Harlow, E., Lane, L. . Antibodies. A laboratory manual. , (1988).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
