العزلة وتوصيف الحويصلات خارج الخلية التي تنتجها الحديد-المحدودة المتفطره
Summary
المتفطره السليه تظهر زيادة إنتاج وإطلاق الحويصلات خارج الخلية استجابه لظروف الحديد المنخفضة. هذا العمل تفاصيل بروتوكول لتوليد الشروط والأساليب منخفضه الحديد لتنقيه وتوصيف الحويصلات المتفطرات خارج الخلية التي صدرت استجابه لنقص الحديد.
Abstract
البكتيريا الفطرية ، بما في ذلك المتفطره السل (Mtb) ، العامل المسبب للسل البشري ، وبطبيعة الشكل الإفراج عن الحويصلات خارج الخلية (المركبات الحيوية) التي تحتوي علي جزيئات نشطه من الناحية المناعية. المعرفة بشان أليات الجزيئية لتكوين الخلايا الحيوية ، ومحتوي الحويصلات ، ووظائفها في واجهه الممرض والمضيف محدوده جدا. ويتطلب التصدي لهذه المسائل إجراءات صارمة للعزل والتنقية والتحقق من صحة المركبات. في السابق ، تم العثور علي إنتاج حويصلة لتعزيز عندما تعرض m. السل لتقييد الحديد ، وهي حاله واجهتها Mtb في البيئة المضيفة. يقدم هنا بروتوكول كامل ومفصل لعزل وتنقيه المركبات الخاصة من المتفطره التي تعاني من نقص الحديد. يتم تطبيق الطرق الكمية والنوعية للتحقق من صحة المركبات الكترونيه المنقية.
Introduction
المتفطرات الحويصلات الخارجة عن الخلية (الميمياس) هي جسيمات نانويه مرتبطة بالغشاء ، 60 − 300 نانومتر في الحجم ، والتي يطلقها بشكل طبيعي المتفطره السريعة والبطيءه النمو1. ميقاف التي أطلقتها المتفطره المسببة للامراض تشكل اليه للتفاعل مع المضيف عن طريق البروتينات النشطة مناعيا ، والدهون ، و جليكوليبيد يفرز في طريقه مركزه ومحمية2،3،4. لتوصيف المولود وفهم تكوينه الحيوي ووظائفه ، فان الطرق الصارمة والفعالة لتنقيه الحويصلة والتحقق منها حاسمه. حتى الآن ، تم عزل المولودين من الترشيحات الثقافية من المتفطره المزروعة في وسط غني بالحديد1،5،6،7،8.
ومع ذلك ، أظهرت الاعمال السابقة ان الحد من الحديد يحفز إلى حد كبير الإفراج عن حويصلة في Mtb ، ربما للتقاط الحديد عن طريق المتفابط ، وهو فلكي يفرز في ميسيس9. وعلي الرغم من ان إجراءات عزل المولود من Mtb المستزرعة في وسط الحديد العالي قد وصفت ، فانه لم يتم الإبلاغ عن منهجيه فعاله للحصول علي المولودين من ثقافات الحديد المنخفضة. ولذلك ، فان الهدف من هذه الطريقة هو عزل وتنقيه وقياس الميس التي تم الحصول عليها من ثقافات الحديد المنخفضة بحيث يمكن استخدامها لاختبارات الكيمياء الحيوية والوظيفية ولتحليل المحددات الوراثية لإنتاج حويصلة في المتفطره.
Protocol
Representative Results
Discussion
وقد تم تطوير أساليب متعددة لتنقيه الخلايا المشتقة النواة الخلوية12. وعلي النقيض من ذلك ، هناك معلومات محدوده عن الطرق الفعالة لتنقيه البكتيريا المشتقة من المركبات7. العزلة الفعالة للمركبات المركبة التي تستمد من Mtb تحتاج إلى النظر في الصعوبات المتاصله في زراعه هذه…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن ممتنون لرافائيل برادوس-روساليس لتقاسم antisera مضاده MEV و Navneet Dogra لأداء تحليل تتبع جسيمات متناهي.
Materials
| Amicon stirred cell Model 108 | EMD Milipore | UFSC40001 | Cell Ultrafiltration system |
| BD Polypropilene 225 ml conical tubes | Fisher | 05-538-61 | Conical centrifuge tubes |
| Biomax 100-kDa cut-off ultrafiltration membrane | EMD Milipore | PBHK07610 | Ultrafiltration membrane |
| Chelex-100 resin | Bio-Rad | 142-2842 | Metal chelating resin |
| Middlebrook 7H10 Agar | BD Difco | 262710 | Mycobacterial Agar plates |
| Middlebrook 7H9 Broth | BD Difco | 271310 | Mycobacterial broth medium |
| Nitro cellulose blotting membrane | GE Healthcare | 10600001 | Blotting Membrane |
| Optiprep | Sigma | D1556 | Iodixanol |
| Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm | Beckman Coulter | 355618 | Polycarbonate ultra centrifugation tubes 25 x 89 mm |
| Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm | Beckman Coulter | 344059 | Polypropylene thin walled centrifuge tube 13×15 mm |
| Protein Assay dye | BioRad | 5000006 | Bradford Protein Staining |
| SYPRO Ruby | Molecular Probes | S12000 | Ultrasensitive protein stain |
| TMA-DPH | Molecular Probes | T204 | 1-(4-Trimethylammoniumphenyl)-6-Phenyl-1,3,5-Hexatriene p-Toluenesulfonate |
| Vacuum filtration flasks | CellPro | V50022 | Filter Unit |
References
- Prados-Rosales, R., et al. Mycobacteria release active membrane vesicles that modulate immune responses in a TLR2-dependent manner in mice. Journal of Clinical Investigation. 121, 1471-1483 (2011).
- Gupta, S., Rodriguez, G. M. Mycobacterial extracellular vesicles and host pathogen interactions. Pathogens and Disease. 76 (4), (2018).
- Athman, J. J., et al. Bacterial Membrane Vesicles Mediate the Release of Mycobacterium tuberculosis Lipoglycans and Lipoproteins from Infected Macrophages. Journal of Immunology. 195, 1044-1053 (2015).
- Athman, J. J., et al. Mycobacterium tuberculosis Membrane Vesicles Inhibit T Cell Activation. Journal of Immunology. 198, 2028-2037 (2017).
- Rath, P., et al. Genetic regulation of vesiculogenesis and immunomodulation in Mycobacterium tuberculosis. Proceedings of the National Academy of Science U.S.A. 110, E4790-E4797 (2013).
- White, D. W., Elliott, S. R., Odean, E., Bemis, L. T., Tischler, A. D. Mycobacterium tuberculosis Pst/SenX3-RegX3 Regulates Membrane Vesicle Production Independently of ESX-5 Activity. mBio. 9, pii 00778 (2018).
- Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6, 1324731 (2017).
- Prados-Rosales, R., Brown, L., Casadevall, A., Montalvo-Quiros, S., Luque-Garcia, J. L. Isolation and identification of membrane vesicle-associated proteins in Gram-positive bacteria and mycobacteria. MethodsX. 1, 124-129 (2014).
- Prados-Rosales, R., et al. Role for Mycobacterium tuberculosis membrane vesicles in iron acquistion. Journal of Bacteriology. 196, 1250-1256 (2014).
- Sanders, E. Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods. Journal of Visualized Experiments. 63, e3064 (2012).
- Harlow, E., Lane, L. . Antibodies. A laboratory manual. , (1988).
- Lotvall, J., et al. Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 26913 (2014).
