Ters Faz Sıvı Kromatografi-Kütle Spektrometresi Ile Hücresiz Protein Sentezmetabolizmasının Mutlak Niceliği
Summary
Burada, hücre siz protein sentezi reaksiyonlarında merkezi karbon ve enerji metabolizmasında yer alan 40 bileşiği ölçmek için sağlam bir protokol salıyoruz. Hücresiz sentez karışımı ters fazlı sıvı kromatografi kullanılarak etkili ayrıştırma için anilin ile türevize edilir ve daha sonra izotopik olarak etiketlenmiş iç standartlar kullanılarak kütle spektrometresi ile ölçülür.
Abstract
Hücresiz protein sentezi (CFPS), proteinlerin in vitro üretimi için sistemlerde ve sentetik biyolojide gelişen bir teknolojidir. Ancak, CFPS laboratuvar ötesine taşımak ve sadece zaman üretim teknolojisi yaygın ve standart haline gidiyor, biz bu sistemlerin performans sınırlarını anlamak gerekir. Bu soruya doğru, glikoliz, pentoz fosfat yolu, trikarboksilik asit döngüsü, enerji metabolizması ve CFPS reaksiyonlarında kofaktör rejenerasyonu ile ilgili 40 bileşiğin ölçülmesi için sağlam bir protokol geliştirdik. Yöntem, 13C-aniline ile etiketlenmiş dahili standartları kullanırken, örnekteki bileşikler 12C-aniline ile türevleştirilmiştir. İç standartlar ve örnek, ters fazlı sıvı kromatografi-kütle spektrometresi (LC/MS) ile karıştırılarak analiz edildi. Bileşiklerin birlikte elüsyonu iyon bastırma ortadan kaldırarak, ortalama korelasyon katsayısının 0.988 olduğu 2-3 büyüklük sırası üzerinde metabolit konsantrasyonlarının doğru nicelemesini sağladı. Kırk bileşiğin beşi anilin ile etiketlenmemiş, ancak CFPS örneğinde hala tespit edilmiş ve standart bir eğri yöntemi ile ölçüldü. Kromatografik koşunun tamamlanması yaklaşık 10 dakika sürer. Birlikte ele alındığında, tek bir LC/MS çalışmasında CFPS’de yer alan 40 bileşimi ayırmak ve doğru bir şekilde ölçmek için hızlı ve sağlam bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem, hücresiz metabolizmayı karakterize etmek için kapsamlı ve doğru bir yaklaşımdır, böylece hücresiz sistemlerin verimini, üretkenliğini ve enerji verimliliğini anlayabilir ve geliştirebiliriz.
Introduction
Hücre içermeyen protein sentezi (CFPS), geleneksel olarak canlı hücreler için ayrılmış bir uygulama olan protein ve kimyasalların üretimi için umut verici bir platformdur. Hücre içermeyen sistemler ham hücre özlerinden türetilmiştir ve hücre büyümesi ile ilişkili komplikasyonları ortadan kaldırır1. Buna ek olarak, CFPS bir hücre duvarının müdahalesi olmadan metabolitleri ve biyosentetik makine doğrudan erişim sağlar. Ancak, hücresiz süreçlerin performans limitleri temel bir anlayış eksik olmuştur. Metabolit nicelliği için yüksek iş yapma yöntemleri metabolizmanın karakterizasyonu için değerlidir ve metabolik hesaplamalı modellerin2,3,4’ünyapımı için çok önemlidir. Metabolit konsantrasyonlarını belirlemek için kullanılan yaygın yöntemler nükleer manyetik rezonans (NMR), Fourier transform-kızılötesi spektroskopi (FT-IR), enzim bazlı tahliller ve kütle spektrometresi (MS)5,6,7 ,8. Ancak, bu yöntemler genellikle verimli bir kerede birden fazla bileşikleri ölçmek için onların yetersizlik ile sınırlıdır ve genellikle tipik hücre içermeyen reaksiyonlar daha büyük bir örnek boyutu gerektirir. Örneğin, enzim bazlı tahliller genellikle yalnızca bir çalışmada tek bir bileşiği ölçmek için kullanılabilir ve hücre içermeyen protein sentezreaksiyonları (genellikle 10-15 μL ölçekte çalıştırılır) gibi örnek boyutu küçük olduğunda sınırlıdır. Bu arada, NMR algılama ve nicelleştirme5için metabolitlerin yüksek bir bolluk gerektirir. Bu eksikliklere doğru, kütle spektrometresi (LC/MS) ile birlikte kromatografi yöntemleri, yüksek duyarlılık ve aynı anda birden fazla türü ölçme yeteneği de dahil olmak üzere çeşitli avantajlar sağlar9; ancak, analitik karmaşıklık ölçülen türlerin sayısı ve çeşitliliği ile önemli ölçüde artmaktadır. Bu nedenle, LC/MS sistemlerinin yüksek iş verme potansiyelini tam olarak gerçekleştirecek yöntemler geliştirmek önemlidir. Numunedeki bileşikler sıvı kromatografi ile ayrılır ve kütle spektrometresi ile tanımlanır. Bileşiğin sinyali, iyonlaşmanın bileşikler arasında değişebileceği ve aynı zamanda numune matrisine de bağlı olabileceği konsantrasyon ve iyonizasyon verimliliğine bağlıdır.
Analizleri ölçmek için LC/MS kullanırken örnek ve standartlar arasında aynı iyonizasyon verimliliğini sağlamak zordur. Ayrıca, proton afinite ve polarite10sinyal bölünmesi ve heterojenite nedeniyle metabolit çeşitliliği ile nicel daha zor hale gelir. Son olarak, numunenin eş-eluting matris de bileşiklerin iyonizasyon verimliliğini etkileyebilir. Bu sorunları gidermek için, metabolitler kimyasal olarak türevlenebilir, LC/MS sistemleri tarafından ayırma çözünürlüğü ve hassasiyeti artırılarak, bazı durumlarda sinyal bölünmesi aynı anda azalırken10,11. Kimyasal türevleştirme, iyonizasyon verimliliğini artırmak için yük veya hidrofobiklik gibi fiziksel özelliklerini ayarlamak için belirli işlevsel metabolit gruplarını etiketleyerek çalışır11. Farklı fonksiyonel grupları (örneğin, aminler, hidroksiller, fosfatlar, karboksilik asitler vb.) hedeflemek için çeşitli etiketleme ajanları kullanılabilir. Anilin, böyle bir tür türtürasyon ajan, aynı anda birden fazla fonksiyonel grupları hedefler ve hidrofilik moleküller içine bir hidrofobik bileşen ekler, bu nedenle onların ayırma çözünürlüğü ve sinyal12artırarak. Birlikte eluting matris iyon bastırma etkisi ele almak için, Yang ve iş arkadaşları standart 13C anilin izotopları ile etiketlenir ve örnek ile karıştırılır Grup Özel İç Standart Teknolojisi (GSIST) etiketleme dayalı bir teknik geliştirdi 12,13. Metabolit ve buna karşılık gelen iç standart, birlikte elute beri aynı iyonlaşma verimliliğine sahip, ve onların yoğunluk oranı deneysel örnek konsantrasyonu ölçmek için kullanılabilir.
Bu çalışmada, CFPS reaksiyonlarında glikoliz, pentoz fosfat yolu, trikarboksilik asit döngüsü, enerji metabolizması ve kofaktör rejenerasyonu ile ilgili 40 bileşiğin saptanması ve ölçülmesi için bir protokol geliştirdik. Yöntem, ters fazLC/MS kullanarak metabolitleri etiketlemek, tespit etmek ve ölçmek için 12C-aniline ve 13C-aniline kullandığımız GSIST yaklaşımına dayanmaktadır. Tüm bileşiklerin doğrusal aralığı 0,988 ortalama korelasyon katsayısı ile 2-3 büyüklük sırasını kapsıyordu. Böylece, yöntem hücresiz metabolizma sorgulamak için sağlam ve doğru bir yaklaşımdır, ve muhtemelen bütün hücre özleri.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hücresiz sistemlerin hücre duvarı yoktur, bu nedenle karmaşık numune hazırlamaya gerek kalmadan metabolitlere ve biyosentetik makinelere doğrudan erişim vardır. Ancak, hücreiçermeyen reaksiyon sistemlerini nicel olarak sorgulamak için kapsamlı ve sağlam protokoller geliştirmek için çok az çalışma yapılmıştır. Bu çalışmada, hücresiz reaksiyon karışımlarında ve potansiyel olarak tüm hücre ekstrelerinde metabolitleri ölçmek için hızlı ve sağlam bir yöntem geliştirdik. Hücreiçermey…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Açıklanan çalışma, Ulusal Kanser Enstitüsü’nden (https://www.cancer.gov/) 1U54CA210184-01 ödül numarası ile Kanser Metabolizması Fiziği Merkezi tarafından desteklenmiştir. İçerik sadece yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Kanser Enstitüsü’nün veya Ulusal Sağlık Enstitüleri’nin resmi görüşlerini temsil etmemektedir. Fon layıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve analiz, makalenin yayımlama kararı veya hazırlanmasında hiçbir rolü yoktu.
Materials
| 12C Aniline | Sigma-Aldrich | 242284 | Aniline 12C |
| 13C labeled aniline | Sigma-Aldrich | 485797 | Aniline 13C6 |
| 3-Phosphoglyceric acid | Sigma-Aldrich | P8877 | 3PG |
| Acetic Acid | FisherScientific | AC222140010 | ACE |
| Acetonitrile, LCMS | JT BAKER | 9829-03 | ACN |
| Acetyl-coenzyme A | Sigma-Aldrich | A2056 | ACA |
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column | Waters | 186002353 | Column |
| Adenosine diphosphate | Sigma-Aldrich | A2754 | ADP |
| Adenosine monophosphate | Sigma-Aldrich | A1752 | AMP |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | ATP |
| Alpha-ketoglutarate | Sigma-Aldrich | K1128 | aKG |
| Citrate | Sigma-Aldrich | 251275 | CIT |
| Cytidine diphosphate | Sigma-Aldrich | C9755 | CDP |
| Cytidine monophosphate | Sigma-Aldrich | C1006 | CMP |
| Cytidine triphosphate | Sigma-Aldrich | C9274 | CTP |
| D-glyceraldehyde 3-phosphate | Sigma-Aldrich | 39705 | GAP |
| Erythrose 4-phosphate | Sigma-Aldrich | E0377 | E4P |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | EX0276 | EtOH |
| Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge | FisherScientific | Centrifuge | |
| Flavin adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | F6625 | FAD |
| Fructose 1,6-bisphosphate | Sigma-Aldrich | F6803 | F16P |
| Fructose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | F3627 | F6P |
| Fumarate | Sigma-Aldrich | F8509 | FUM |
| Gluconate 6-phosphate | Sigma-Aldrich | P7877 | 6PG |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | GLC |
| Glucose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | G7879 | G6P |
| Glycerol 3-phosphate | Sigma-Aldrich | G7886 | Gly3P |
| Guanosine diphosphate | Sigma-Aldrich | G7127 | GDP |
| Guanosine monophosphate | Sigma-Aldrich | G8377 | GMP |
| Guanosine triphosphate | Sigma-Aldrich | G8877 | GTP |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | HCl |
| Isocitrate | Sigma-Aldrich | I1252 | ICIT |
| Lactate | Sigma-Aldrich | L1750 | LAC |
| Malate | Sigma-Aldrich | 02288 | MAL |
| myTXTL – Sigma 70 Master Mix Kit | ArborBiosciences | 507024 | Cell-free protein synthesis |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 | EDC |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | 43410 | NAD |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | N5755 | NADP |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced | Sigma-Aldrich | 481973 | NADPH |
| Nicotinamide adenine dinucleotide reduced | Sigma-Aldrich | N8129 | NADH |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | OAA |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma-Aldrich | P0564 | PEP |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | PYR |
| Ribose 5-phosphate | Sigma-Aldrich | R7750 | R5P |
| Ribulose 5-phosphate | CarboSynth | MR45852 | RL5P |
| Sedoheptulose 7-phosphate | CarboSynth | MS07457 | S7P |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S3674 | SUCC |
| Tributylamine | Sigma-Aldrich | 90780 | TBA |
| Triethylamine | FisherScientific | O4884 | TEA |
| ultrapure water | FisherScientific | 10977-015 | water |
| Uridine diphosphate | Sigma-Aldrich | U4125 | UDP |
| Uridine monophosphate | Sigma-Aldrich | U6375 | UMP |
| Uridine triphosphate | Sigma-Aldrich | U6625 | UTP |
| VWR Heavy Duty Vortex | VWR | Vortex | |
| Water, LCMS | JT BAKER | 9831-03 | WATER |
| Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity Qda detector | Waters | LCMS | |
| Waters Empower 3 | Waters | Software | |
| Waters LCMS Total Recovery Vial | Waters | 186000384c | LCMS Vial |
References
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).
- Vilkhovoy, M., et al. Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).
- Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. Effective dynamic models of metabolic networks. IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).
- Horvath, N., et al. Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli. bioRxiv. , 215012 (2017).
- Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).
- Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., François, J. Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi. FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).
- Ruijter, G. J. G., Visser, J. Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).
- Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations. Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).
- Dunn, W. B., et al. Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics. Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).
- Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry. Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).
- Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology. Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).
- Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling. Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).
- Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J., Metz, T. O. Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS). Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). , 159-171 (2011).
- Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).
