Абсолютная количественная количественная количественная количественная метания белка без клеток путем обратной фазы жидкой хроматографии-масс-спектрометрии

Синтез белка без клеток (CFPS) является перспективной платформой для производства белков и химических веществ, приложение, которое традиционно зарезервировано для живых клеток. Системы, свободные от клеток, получены из экстрактов сырой клетки и устраняют осложнения, связанные с ростом клеток^1. Кроме того, CFPS обеспечивает прямой доступ к метаболитам и биосинтетическому оборудованию без вмешательства клеточной стенки. Однако фундаментальное понимание пределов производительности процессов, свободных от клеток, отсутствует. Высокопроизводительные методы метаболитной количественной оценки имеют важное значение для характеристики метаболизма и имеют решающее значение для построения метаболических вычислительных моделей^2,3,4. Общие методы, используемые для определения концентрации метаболита включают ядерный магнитный резонанс (NMR), Фурье трансинфракрасной спектроскопии (FT-IR), ферментнаосновения и масс-спектрометрии (MS)^{5,6,7 ,8}. Однако эти методы часто ограничиваются их неспособностью эффективно измерять несколько соединений одновременно и часто требуют размера выборки, превышающее типичные реакции, свободные от клеток. Например, анализы на основе ферментов часто могут использоваться только для количественной оценки одного соединения в пробеге, и ограничены, когда размер выборки мал, например, в реакции синтеза белка без клеток (обычно работают по шкале 10-15 л). Между тем, ЯМР требует высокого изобилия метаболитов для обнаружения и количественной оценки⁵.  К этим недостаткам, методы хроматографии в тандеме с масс-спектрометрией (LC/MS) обеспечивают несколько преимуществ, включая высокую чувствительность и возможность измерения нескольких видов одновременно^9; однако сложность аналитических исследований значительно возрастает по мере измерения количества и разнообразия видов. Поэтому важно разработать методы, которые в полной мере реализуют высокопроизводительный потенциал систем LC/MS. Соединения в образце разделены жидкой хроматографией и идентифицируются с помощью масс-спектрометрии. Сигнал соединения зависит от его концентрации и эффективности ионизации, где ионизация может варьироваться между соединениями, а также может зависеть от матрицы образца.

Достижение той же эффективности ионизации между образцом и стандартами является сложной задачей при использовании LC/MS для количественной оценки анализов. Кроме того, количественная оценка становится все более сложной задачей с метаболитным разнообразием из-за расщепления сигналов и неоднородности в сродстве протона и полярности¹⁰. Наконец, матрица совместного использования образца может также влиять на эффективность ионизации соединений. Для решения этих проблем метаболиты могут быть химически производными, увеличивая разрешение разделения и чувствительность систем LC/MS, одновременно уменьшая расщепление сигнала в некоторых случаях^10,11. Химическая произвена работает путем пометки конкретных функциональных групп метаболитов, чтобы настроить их физические свойства, такие как заряд или гидрофобность для повышения эффективности ионизации^11. Различные метки могут быть использованы для целевых различных функциональных групп (например, амины, гидроксилы, фосфаты, карбоксиловая кислоты и т.д.). Анилин, один из таких агентов производной, цели нескольких функциональных групп одновременно, и добавляет гидрофобный компонент в гидрофильных молекул, тем самым увеличивая их разделение резолюции и^{сигнал12}. Для решения эффекта подавления ко-элюлинга матрицы Ян и его коллеги разработали методику, основанную на маркировке групповых специфических внутренних стандартных технологий (GSIST), где стандарты маркируются 13-c-изотопов анилина и смешиваются с образцом ^12,13. Метаболит и соответствующий внутренний стандарт имеют одинаковую эффективность ионизации, поскольку они совместно элютируются, и коэффициент их интенсивности может быть использован для количественной оценки концентрации в экспериментальной выборке.

В этом исследовании мы разработали протокол для обнаружения и количественной оценки 40 соединений, участвующих в гликолизе, пентоза фосфатпуть, трикарбоксиловая кислота цикла, метаболизм энергии и кофактор регенерации в CFPS реакций. Метод основан на подходе GSIST, где мы использовали ¹²C-анилин и ¹³C-анилин для тегов, обнаружения и количественной оценки метаболитов с помощью обратной фазы LC/MS. Линейный диапазон всех соединений охватывал 2-3 порядка величины со средним коэффициентом корреляции 0,988. Таким образом, метод является надежным и точным подходом к допросу клеточного метаболизма, и, возможно, цельноклеточных экстрактов.