Quantificazione assoluta del metabolismo della sintesi proteica senza cellule da demografia-cromometria di massa a fase reverse

La sintesi delle proteine prive di cellule (CFPS) è una piattaforma promettente per la produzione di proteine e sostanze chimiche, un’applicazione tradizionalmente riservata alle cellule viventi. I sistemi senza cellule sono derivati da estratti di cellule grezze ed eliminano le complicazioni associate alla crescita cellulare¹. Inoltre, CFPS consente l’accesso diretto ai metaboliti e ai macchinari biosintetici senza l’interferenza di una parete cellulare. Tuttavia, è stata carente una comprensione fondamentale dei limiti di prestazioni dei processi senza cellule. I metodi ad alta produttività per la quantificazione dei metaboliti sono preziosi per la caratterizzazione del metabolismo e sono fondamentali per la costruzione di modelli metabolici computazionali^2,3,4. I metodi più comuni utilizzati per determinare le concentrazioni di metaboliti includono la risonanza magnetica nucleare (NMR), la spettroscopia a infrarossi a infrarossi di Fourier (FT-IR), i saggi basati su enzimi e la spettrometria di massa (MS)^{5,6,7 ,8}. Tuttavia, questi metodi sono spesso limitati dalla loro incapacità di misurare in modo efficiente più composti contemporaneamente e spesso richiedono una dimensione del campione maggiore rispetto alle tipiche reazioni senza cellule. Ad esempio, i saggi basati su enzimi spesso possono essere utilizzati solo per quantificare un singolo composto in una corsa e sono limitati quando la dimensione del campione è piccola, ad esempio nelle reazioni di sintesi proteica priva di cellule (tipicamente eseguite su una scala 10-15). Nel frattempo, NMR richiede un’elevata abbondanza di metaboliti per il rilevamento e la quantificazione⁵.  Verso queste carenze, i metodi di cromatografia in tandem con la spettrometria di massa (LC/MS) offrono diversi vantaggi, tra cui l’elevata sensibilità e la capacità di misurare più specie contemporaneamente⁹; tuttavia, la complessità analitica aumenta considerevolmente con il numero e la diversità delle specie misurate. È quindi importante sviluppare metodi in grado di realizzare appieno il potenziale ad alta produttività dei sistemi LC/MS. I composti in un campione sono separati dalla cromatografia liquida e identificati attraverso la spettrometria di massa. Il segnale del composto dipende dalla sua efficienza di concentrazione e ionizzazione, dove la ionizzazione può variare tra i composti e può anche dipendere dalla matrice del campione.

Raggiungere la stessa efficienza di ionizzazione tra il campione e gli standard è una sfida quando si utilizza LC/MS per quantificare gli analiti. Inoltre, la quantificazione diventa più impegnativa con la diversità dei metaboliti a causa della divisione del segnale e dell’eterogeneità nell’affinità protonica e nella polarità¹⁰. Infine, la matrice di co-eluting del campione può anche influenzare l’efficienza della ionizzazione dei composti. Per risolvere questi problemi, i metaboliti possono essere derivati chimicamente, aumentando la risoluzione di separazione e la sensibilità da parte dei sistemi LC/MS, riducendo contemporaneamente la suddivisione del segnale in alcuni casi^10,11. La derivazione chimica funziona etichettando specifici gruppi funzionali di metaboliti per regolare le loro proprietà fisiche come carica o idrofobicità per aumentare l’efficienza di ionizzazione¹¹. Vari agenti di etichettatura possono essere utilizzati per indirizzare diversi gruppi funzionali (ad esempio, ammine, idrossidi, fosfati, acidi carboxylici, ecc.). Aniline, uno di questi agenti di derivazione, si rivolge a più gruppi funzionali contemporaneamente, e aggiunge un componente idrofobico in molecole idrofile, aumentando così la loro risoluzione di separazione e il segnale¹². Per affrontare l’effetto di soppressione degli ioni a matrice co-elutazione, Yang e i colleghi hanno sviluppato una tecnica basata sull’etichettatura GSIST (Group Specific Internal Standard Technology) in cui gli standard sono contrassegnati con isotopi di anilinea ¹³C e mescolati con il campione ^12,13. Il metabolita e il corrispondente standard interno hanno la stessa efficienza di ionizzazione dal momento che co-eluito, e il loro rapporto di intensità può essere utilizzato per quantificare la concentrazione nel campione sperimentale.

In questo studio, abbiamo sviluppato un protocollo per rilevare e quantificare 40 composti coinvolti nella glicolisi, la via del fosfato pentosi, il ciclo dell’acido tricarboxyillico, il metabolismo energetico e la rigenerazione del cofattore nelle reazioni CFPS. Il metodo si basa sull’approccio GSIST, dove abbiamo usato ¹²C-anilina e ¹³C-anilina per etichettare, rilevare e quantificare i metaboliti utilizzando LC/MS in fase invertita. La gamma lineare di tutti i composti si estendeva su 2-3 ordini di grandezza con un coefficiente di correlazione medio di 0,988. Così, il metodo è un approccio robusto e preciso per interrogare il metabolismo senza cellule, e possibilmente estratti interi cellulari.