Quantification absolue du métabolisme de synthèse des protéines sans cellules par spectrométrie de chromatographie liquide à phase inversée

La synthèse des protéines sans cellules (CFPS) est une plate-forme prometteuse pour la fabrication de protéines et de produits chimiques, une application traditionnellement réservée aux cellules vivantes. Les systèmes sans cellules sont dérivés d’extraits de cellules brutes et éliminent les complications associées à la croissance cellulaire¹. En outre, le SCFP permet un accès direct aux métabolites et aux machines biosynthétiques sans interférence d’une paroi cellulaire. Cependant, il n’y a pas eu de compréhension fondamentale des limites de rendement des processus sans cellules. Les méthodes à haut débit pour la quantification des métabolites sont précieuses pour la caractérisation du métabolisme et sont essentielles pour la construction de modèles de calcul^{métaboliques 2,3,4}. Les méthodes courantes utilisées pour déterminer les concentrations de métabolites comprennent la résonance magnétique nucléaire (RMN), la spectroscopie à infrarouge transformateur (FT-IR) de Fourier, les essais à base d’enzymes et la spectrométrie de masse (MS)^{5,6,7 ,8}. Cependant, ces méthodes sont souvent limitées par leur incapacité à mesurer efficacement plusieurs composés à la fois et nécessitent souvent une taille d’échantillon supérieure aux réactions typiques sans cellules. Par exemple, les essais à base d’enzymes ne peuvent souvent être utilisés que pour quantifier un seul composé dans une course, et sont limités lorsque la taille de l’échantillon est petite, comme dans les réactions de synthèse des protéines sans cellules (généralement exécuté sur une échelle de 10-15 L). Pendant ce temps, la RMN exige une forte abondance de métabolites pour la détection et la quantification⁵.  À l’égard de ces lacunes, les méthodes de chromatographie en tandem avec la spectrométrie de masse (LC/MS) offrent plusieurs avantages, y compris une sensibilité élevée et la capacité de mesurer plusieurs espèces simultanément^9; cependant, la complexité analytique augmente considérablement avec le nombre et la diversité des espèces mesurées. Il est donc important de développer des méthodes qui réalisent pleinement le potentiel de haut débit des systèmes LC/MS. Les composés d’un échantillon sont séparés par chromatographie liquide et identifiés par spectrométrie de masse. Le signal du composé dépend de sa concentration et de son efficacité d’ionisation, où l’ionisation peut varier d’un composé à l’autre et peut également dépendre de la matrice de l’échantillon.

Atteindre la même efficacité d’ionisation entre l’échantillon et les normes est un défi lorsque vous utilisez LC/MS pour quantifier les analytes. En outre, la quantification devient plus difficile avec la diversité des métabolites en raison de la division du signal et de l’hétérogénéité dans l’affinité des protons et la polarité¹⁰. Enfin, la matrice de co-élutation de l’échantillon peut également affecter l’efficacité de l’ionisation des composés. Pour résoudre ces problèmes, les métabolites peuvent être dérivés chimiquement, ce qui augmente la résolution et la sensibilité de séparation par les systèmes LC/MS, tout en diminuant simultanément le fractionnement du signal dans certains cas^10,11. La dérivation chimique fonctionne en étiquetant des groupes fonctionnels spécifiques de métabolites pour ajuster leurs propriétés physiques comme la charge ou l’hydrophobicité pour augmenter l’efficacité de l’ionisation¹¹. Divers agents de marquage peuvent être utilisés pour cibler différents groupes fonctionnels (p. ex. amines, hydroxyles, phosphates, acides carboxyliques, etc.). L’aniline, l’un de ces agents de dérivation, cible plusieurs groupes fonctionnels à la fois, et ajoute un composant hydrophobe dans les molécules hydrophiles, augmentant ainsi leur résolution de séparation et le signal¹². Pour faire face à l’effet de suppression des ions de la matrice co-étui, Yang et ses collègues ont mis au point une technique basée sur l’étiquetage de la technologie standard interne spécifique au groupe (GSIST) lorsque les normes sont étiquetées avec des isotopes aniin de ¹³C et mélangées à l’échantillon. ^12,13. Le métabolite et la norme interne correspondante ont la même efficacité d’ionisation puisqu’ils co-éliment, et leur rapport d’intensité peut être utilisé pour quantifier la concentration dans l’échantillon expérimental.

Dans cette étude, nous avons développé un protocole pour détecter et quantifier 40 composés impliqués dans la glycolyse, la voie de phosphate de pentose, le cycle d’acide tricarboxylique, le métabolisme énergétique et la régénération cofactorielle dans les réactions de CFPS. La méthode est basée sur l’approche GSIST, où nous avons utilisé ¹²C-aniline et ¹³C-aniline pour étiqueter, détecter et quantifier les métabolites à l’aide de LC/MS en phase inversée. La plage linéaire de tous les composés s’étendait sur 2-3 ordres de grandeur avec un coefficient de corrélation moyen de 0,988. Ainsi, la méthode est une approche robuste et précise pour interroger le métabolisme sans cellules, et peut-être des extraits de cellules entières.