Absolute kwantificering van de Celvrije eiwitsynthese metabolisme door omgekeerde fase vloeistofchromatografie-massaspectrometrie

Cel-vrije eiwitsynthese (CFPS) is een veelbelovend platform voor de vervaardiging van eiwitten en chemicaliën, een toepassing die traditioneel is gereserveerd voor levende cellen. Cel-vrije systemen zijn afgeleid van ruwe celextracten en elimineren de complicaties geassocieerd met celgroei¹. Bovendien biedt CFPS directe toegang tot metabolieten en de biosynthetische machines zonder interferentie van een celwand. Een fundamenteel begrip van de prestatiegrenzen van de cel-vrije processen ontbreekt echter. High-throughput methoden voor de kwantificering van metaboliet zijn waardevol voor de karakterisering van het metabolisme en zijn van cruciaal belang voor de bouw van metabole computationele modellen^2,3,4. Veelgebruikte methoden voor het bepalen van de metaboliet concentraties zijn nucleaire magnetische resonantie (NMR), Fourier-transformatie-infraroodspectroscopie (FT-IR), enzym gebaseerde testen en massaspectrometrie (MS)^{5,6,7 ,8}. Echter, deze methoden worden vaak beperkt door hun onvermogen om efficiënt te meten van meerdere verbindingen tegelijk en vereisen vaak een steekproefgrootte groter is dan de typische cel-vrije reacties. Bijvoorbeeld, enzym gebaseerde assays kunnen vaak alleen worden gebruikt voor het kwantificeren van één samengestelde in een run, en zijn beperkt wanneer de grootte van het monster klein is, zoals in de cel-vrije eiwitsynthese Reacties (meestal uitgevoerd op een schaal van 10-15 μL). Ondertussen vereist NMR een grote overvloed aan metabolieten voor detectie en kwantificering⁵.  In de richting van deze tekortkomingen bieden chromatografie methoden in combinatie met massaspectrometrie (LC/MS) verschillende voordelen, waaronder hoge gevoeligheid en de mogelijkheid om meerdere soorten gelijktijdig te meten⁹; de analytische complexiteit neemt echter aanzienlijk toe met het aantal en de diversiteit van de soorten die worden gemeten. Het is daarom belangrijk om methoden te ontwikkelen die het hoge doorvoer potentieel van LC/MS-systemen volledig realiseren. Verbindingen in een monster worden gescheiden door vloeistofchromatografie en geïdentificeerd door middel van massaspectrometrie. Het signaal van de verbinding hangt af van de concentratie en de ionisatie-efficiëntie, waarbij de ionisatie kan variëren tussen verbindingen en kan ook afhangen van de monstermatrix.

Het bereiken van dezelfde ionisatie-efficiëntie tussen het monster en de normen is een uitdaging bij het gebruik van LC/MS om analyten te kwantificeren. Verder wordt kwantificering uitdagender met de diversiteit van de metaboliet als gevolg van signaal splitsing en heterogeniteit in Proton affiniteit en polariteit¹⁰. Ten slotte kan de co-eluting-matrix van het monster ook invloed hebben op de ionisatie-efficiëntie van de verbindingen. Om deze problemen aan te pakken, kunnen metabolieten chemisch worden afgeleid, waardoor de scheidings resolutie en gevoeligheid door LC/MS-systemen worden vergroot, terwijl tegelijkertijd de signaal splitsing in sommige gevallen^10,11wordt verlaagd. Chemische derivatisatie werkt door specifieke functionele groepen van metabolieten te taggen om hun fysische eigenschappen zoals charge of hydrofobiciteit aan te passen om de ionisatie-efficiëntie te verhogen¹¹. Verschillende tagstoffen kunnen worden gebruikt om verschillende functionele groepen te targeten (bijv. amines, hydroxyls, fosfaten, carbonzuren, enz.). Aniline, een dergelijke derivatisatie-agent, richt zich op meerdere functionele groepen tegelijk, en voegt een hydrofobe component toe aan hydrofiele moleculen, waardoor hun scheidings resolutie en signaal¹²toenemen. Om het co-eluting-matrix-ionen onderdrukkings effect aan te pakken, ontwikkelden Yang en collega’s een techniek op basis van groepsspecifieke interne standaard technologie (GSIST)-labeling waarbij normen zijn gelabeld met ¹³C aniline-isotopen en vermengd met het monster ^12,13. De metaboliet en de corresponderende interne standaard hebben dezelfde ionisatie-efficiëntie omdat ze co-elute, en hun intensiteit ratio kan worden gebruikt om de concentratie in het experimentele monster te kwantificeren.

In deze studie ontwikkelden we een protocol voor het opsporen en kwantificeren van 40 verbindingen die betrokken zijn bij de glycolyse, de pentose fosfaat pathway, de tricarboxylzuurcyclus, het energiemetabolisme en de cofactor-regeneratie bij CFPS-reacties. De methode is gebaseerd op de GSIST-benadering, waarbij we ¹²c-aniline en ¹³c-aniline gebruikten om metabolieten te taggen, te detecteren en te kwantificeren met behulp van omgekeerde fase LC/MS. Het lineaire bereik van alle verbindingen omspannen 2-3 ordes van grootte met een gemiddelde correlatiecoëfficiënt van 0,988. Dus, de methode is een robuuste en nauwkeurige benadering van interrogaat cel-vrije metabolisme, en eventueel hele-celextracten.