التحديد الكمي المطلق لاستقلاب تخليق البروتين الخالي من الخلايا بواسطة الفصل اللوني السائل للمرحلة المعكوسة
Summary
هنا ، نقدم بروتوكولا قويا لقياس 40 المركبات المشاركة في استقلاب الكربون المركزي والطاقة في تفاعلات تخليق البروتين الخالية من الخلايا. وديريفاتيزيد خليط التوليف الخالي من الخلايا مع الانيلين للفصل الفعال باستخدام الفصل اللوني السائل للمرحلة المعكوسة ثم تحديده كميا عن طريق قياس الطيف الكتلي باستخدام معايير داخلية موسومة بالنظائر.
Abstract
تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) هو تكنولوجيا ناشئه في النظم والبيولوجيا التركيبية لإنتاج البروتينات في المختبر. ومع ذلك ، إذا CFPS هو الذهاب إلى الانتقال إلى ما وراء المختبر وتصبح واسعه النطاق والقياسية فقط في الوقت تصنيع التكنولوجيا ، يجب علينا ان نفهم حدود الأداء لهذه الانظمه. نحو هذا السؤال ، قمنا بتطوير بروتوكول قوي لتحديد كميه المركبات 40 المشاركة في تحلل الجلوكوز ، ومسار الفوسفات خماسي ، ودوره حمض تريكاربوكسيليك ، واستقلاب الطاقة وتجديد العامل المساعد في تفاعلات cfps. يستخدم الأسلوب المعايير الداخلية الموسومة مع 13ج-الانيلين ، في حين ان المركبات في العينة هي ديريفاتيزيد مع 12ج-الانيلين. وكانت المعايير والعينات الداخلية مختلطة ومحلله بواسطة الفصل اللوني السائل للمرحلة المعكوسة-قياس الطيف الكتلي (LC/MS). التخلص من المركبات القضاء علي قمع الأيونات ، والسماح للقياس الدقيق لتركيزات المستقلب أكثر من 2-3 أوامر الحجم حيث كان معامل الارتباط المتوسط 0.988. وكانت خمسه من المركبات 40 غير الموسومة مع الانيلين ، ومع ذلك ، كانت لا تزال الكشف عنها في عينه CFPS وكميتها مع طريقه منحني قياسي. يستغرق التشغيل الكروماتوغرافي حوالي 10 دقائق لإكماله. معا ، قمنا بتطوير طريقه سريعة وقويه لفصل وتحديد كميات 40 المركبات المشاركة في CFPS في واحد LC/MS تشغيل. الأسلوب هو نهج شامل ودقيق لتوصيف الأيض خاليه من الخلايا ، بحيث في نهاية المطاف ، يمكننا فهم وتحسين الغلة والانتاجيه وكفاءه الطاقة من الانظمه الخالية من الخلايا.
Introduction
تخليق البروتين الخالي من الخلايا (CFPS) هو منصة واعده لتصنيع البروتينات والمواد الكيميائية ، وهو التطبيق الذي تم حجزه تقليديا للخلايا الحية. وتستمد الانظمه الخالية من الخلايا من مستخلصات الخلايا الخام وتزيل المضاعفات المرتبطة بنمو الخلايا1. الاضافه إلى ذلك ، يسمح CFPS للوصول المباشر إلى الأيض وآلات الحيوية دون تدخل جدار الخلية. ومع ذلك ، فقد افتقر إلى فهم أساسي لحدود أداء العمليات الخالية من الخلايا. الطرق عاليه الانتاجيه للقياس المستقلب هي قيمه لتوصيف الأيض وحاسمه لبناء نماذج الحسابية الايضيه2,3,4. وتشمل الأساليب الشائعة المستخدمة لتحديد تركيزات المستقلب الرنين المغناطيسي النووي (nmr) ، تحويل fourier-الطيفي الاشعه تحت الحمراء (FT-IR) ، والاختبارات القائمة علي انزيم ، والطيف الكتلي (MS)5،6،7 ،8. ومع ذلك ، غالبا ما تكون هذه الطرق محدوده بسبب عدم قدرتها علي قياس مركبات متعددة بكفاءة في ان واحد ، وغالبا ما تتطلب حجم عينه أكبر من ردود الفعل النموذجية الخالية من الخلايا. علي سبيل المثال ، يمكن غالبا استخدام الاختبارات المستندة إلى الانزيم فقط لقياس مركب واحد في التشغيل ، وتكون محدوده عندما يكون حجم العينة صغيرا ، مثل تفاعلات تخليق البروتين الخالية من الخلايا (عاده ما يتم تشغيلها علي مقياس 10-15 μL). وفي الوقت نفسه ، يتطلب NMR وفره عاليه من نواتج الأيض للكشف والتقدير الكمي5. النسبة لأوجه القصور هذه ، توفر أساليب الفصل اللوني بالترادف مع قياس الطيف الكتلي (LC/MS) العديد من المزايا ، بما في ذلك الحساسية العالية وقدره الأنواع المتعددة فيان واحد فينفس الوقت ؛ ومع ذلك ، فان التعقيد التحليلي يزيد كثيرا مع عدد وتنوع الأنواع التي يجري قياسها. ولذلك ، من المهم تطوير أساليب تحقق بالبالكامل الإمكانات العالية الانتاجيه لأنظمه LC/MS. يتم فصل المركبات في عينه بواسطة اللوني السائل وتحديدها من خلال قياس الطيف الكتلي. تعتمد اشاره المركب علي تركيزه وكفاءه التاين ، حيث يمكن ان يختلف التاين بين المركبات وقد يعتمد أيضا علي مصفوفة العينة.
ويمثل تحقيق نفس كفاءه التاين بين العينة والمعايير تحديا عند استخدام LC/MS لقياس التحاليل. وعلاوة علي ذلك ، يصبح القياس الكمي أكثر تحديا مع تنوع المستقلب بسبب تقسيم الاشاره والتغاير في تقارب البروتون والقطبية10. وأخيرا ، يمكن لمصفوفة العينة المشتركة ان تؤثر أيضا علي كفاءه تاين المركبات. لمعالجه هذه القضايا ، يمكن ان تكون الأيض ديريفاتيزيد كيميائيا ، وزيادة دقه الفصل والحساسية من قبل أنظمه LC/MS ، في حين خفض تقسيم الاشاره في وقت واحد في بعض الحالات10،11. اشتقاق الكيميائية يعمل عن طريق وضع علامات مجموعات وظيفية محدده من الأيض لضبط خصائصها الفيزيائية مثل تهمه أو هيدروفوبيسيتي لزيادة كفاءه التاين11. يمكن استخدام عوامل الوسم المختلفة لاستهداف مجموعات وظيفية مختلفه (علي سبيل المثال ، الأمينات ، هيدروكسي ls ، الفوسفات ، الأحماض الكربوكسيليه ، الخ). انيلين ، واحده من هذه العوامل اشتقاق ، تستهدف مجموعات وظيفية متعددة في وقت واحد ، ويضيف مكون مسعور في جزيئات هيدروفيله ، التالي زيادة قرار الانفصال واشاره12. للتصدي للتاثير المشترك لقمع أيون المصفوفة ، قام يانغ وزملاء البحث بتطوير تقنيه تستند إلى وضع العلامات الخاصة بالتكنولوجيا القياسية الداخلية الخاصة بالمجموعة (جسيست) حيث يتم تمييز المعايير مع نظائر الانيلين 13ج ومزجها مع العينة 12,13. المستقلب والمعايير الداخلية المقابلة لها نفس كفاءه التاين لأنها مشتركه ، ويمكن استخدام نسبه شدتها لقياس التركيز في العينة التجريبية.
في هذه الدراسة ، قمنا بتطوير بروتوكول للكشف عن وكميه 40 المركبات المشاركة في تحلل الجلوكوز ، والمسار الفوسفات البنتوز ، ودوره حمض تريكاربوكسيليك ، واستقلاب الطاقة وتجديد العامل المساعد في تفاعلات cfps. ويستند هذا الأسلوب علي نهج جسيست, حيث استخدمنا 12ج-الانيلين و 13ج-الانيلين لوسم, كشف, وقياس الأيض باستخدام عكس المرحلة LC/MS. وامتدت المجموعة الخطية لجميع المركبات 2-3 أوامر الحجم بمعامل ارتباط متوسطه 0.988. التالي ، فان الأسلوب هو نهج قوي ودقيق لاستجواب الأيض خاليه من الخلايا ، وربما مقتطفات خليه كامله.
Protocol
Representative Results
Discussion
أنظمه خاليه من الخلايا ليس لديها جدار الخلية ، التالي هناك امكانيه الوصول المباشر إلى الأيض وآلات الحيوية دون الحاجة إلى اعداد عينه معقده. غير انه لم ينجز سوي القليل جدا من العمل لوضع بروتوكولات شامله وقويه لاجراء الاستجواب الكمي لنظم رد الفعل الخالي من الخلايا. في هذه الدراسة ، قمنا بتطو?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم العمل الموصوف من قبل المركز علي فيزياء استقلاب السرطان من خلال الجائزة رقم 1U54CA210184-01 من المعهد الوطني للسرطان (https://www.cancer.gov/). المحتوي هو فقط مسؤوليه المؤلفين ولا يمثل بالضرورة الآراء الرسمية للمعهد الوطني للسرطان أو المعاهد الوطنية للصحة. ولم يكن لدي الممولين اي دور في تصميم الدراسة ، وجمع البيانات وتحليلها ، واتخاذ قرار بنشر المخطوطة أو اعدادها.
Materials
| 12C Aniline | Sigma-Aldrich | 242284 | Aniline 12C |
| 13C labeled aniline | Sigma-Aldrich | 485797 | Aniline 13C6 |
| 3-Phosphoglyceric acid | Sigma-Aldrich | P8877 | 3PG |
| Acetic Acid | FisherScientific | AC222140010 | ACE |
| Acetonitrile, LCMS | JT BAKER | 9829-03 | ACN |
| Acetyl-coenzyme A | Sigma-Aldrich | A2056 | ACA |
| Acquity UPLC BEH C18 1.7 μM, 2.1 x 150 mm Column | Waters | 186002353 | Column |
| Adenosine diphosphate | Sigma-Aldrich | A2754 | ADP |
| Adenosine monophosphate | Sigma-Aldrich | A1752 | AMP |
| Adenosine triphosphate | Sigma-Aldrich | A2383 | ATP |
| Alpha-ketoglutarate | Sigma-Aldrich | K1128 | aKG |
| Citrate | Sigma-Aldrich | 251275 | CIT |
| Cytidine diphosphate | Sigma-Aldrich | C9755 | CDP |
| Cytidine monophosphate | Sigma-Aldrich | C1006 | CMP |
| Cytidine triphosphate | Sigma-Aldrich | C9274 | CTP |
| D-glyceraldehyde 3-phosphate | Sigma-Aldrich | 39705 | GAP |
| Erythrose 4-phosphate | Sigma-Aldrich | E0377 | E4P |
| Ethanol | Sigma-Aldrich | EX0276 | EtOH |
| Fisher Scientific accuSpin Micro 17 Centrifuge | FisherScientific | Centrifuge | |
| Flavin adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | F6625 | FAD |
| Fructose 1,6-bisphosphate | Sigma-Aldrich | F6803 | F16P |
| Fructose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | F3627 | F6P |
| Fumarate | Sigma-Aldrich | F8509 | FUM |
| Gluconate 6-phosphate | Sigma-Aldrich | P7877 | 6PG |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | GLC |
| Glucose 6-phosphate | Sigma-Aldrich | G7879 | G6P |
| Glycerol 3-phosphate | Sigma-Aldrich | G7886 | Gly3P |
| Guanosine diphosphate | Sigma-Aldrich | G7127 | GDP |
| Guanosine monophosphate | Sigma-Aldrich | G8377 | GMP |
| Guanosine triphosphate | Sigma-Aldrich | G8877 | GTP |
| Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | 258148 | HCl |
| Isocitrate | Sigma-Aldrich | I1252 | ICIT |
| Lactate | Sigma-Aldrich | L1750 | LAC |
| Malate | Sigma-Aldrich | 02288 | MAL |
| myTXTL – Sigma 70 Master Mix Kit | ArborBiosciences | 507024 | Cell-free protein synthesis |
| N-(3-dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma-Aldrich | 03449 | EDC |
| Nicotinamide adenine dinucleotide | Sigma-Aldrich | 43410 | NAD |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate | Sigma-Aldrich | N5755 | NADP |
| Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate reduced | Sigma-Aldrich | 481973 | NADPH |
| Nicotinamide adenine dinucleotide reduced | Sigma-Aldrich | N8129 | NADH |
| Oxalacetate | Sigma-Aldrich | O4126 | OAA |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma-Aldrich | P0564 | PEP |
| Pyruvate | Sigma-Aldrich | P5280 | PYR |
| Ribose 5-phosphate | Sigma-Aldrich | R7750 | R5P |
| Ribulose 5-phosphate | CarboSynth | MR45852 | RL5P |
| Sedoheptulose 7-phosphate | CarboSynth | MS07457 | S7P |
| Succinate | Sigma-Aldrich | S3674 | SUCC |
| Tributylamine | Sigma-Aldrich | 90780 | TBA |
| Triethylamine | FisherScientific | O4884 | TEA |
| ultrapure water | FisherScientific | 10977-015 | water |
| Uridine diphosphate | Sigma-Aldrich | U4125 | UDP |
| Uridine monophosphate | Sigma-Aldrich | U6375 | UMP |
| Uridine triphosphate | Sigma-Aldrich | U6625 | UTP |
| VWR Heavy Duty Vortex | VWR | Vortex | |
| Water, LCMS | JT BAKER | 9831-03 | WATER |
| Waters Acquity H UPLC Class Quaternary Solvent Manager | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity H UPLC Class Sample Manager FTN | Waters | LCMS | |
| Waters Acquity Qda detector | Waters | LCMS | |
| Waters Empower 3 | Waters | Software | |
| Waters LCMS Total Recovery Vial | Waters | 186000384c | LCMS Vial |
References
- Hodgman, C. E., Jewett, M. C. Cell-free synthetic biology: thinking outside the cell. Metabolic Engineering. 14, 261-269 (2012).
- Vilkhovoy, M., et al. Sequence specific modeling of E. coli cell-free protein synthesis. ACS Synthetic Biology. 7 (8), 1844-1857 (2018).
- Vilkhovoy, M., Minot, M., Varner, J. D. Effective dynamic models of metabolic networks. IEEE Life Sciences Letters. 2 (4), 51-54 (2016).
- Horvath, N., et al. Toward a genome scale sequence specific dynamic model of cell-free protein synthesis in Escherichia coli. bioRxiv. , 215012 (2017).
- Dettmer, K., Aronov, P. A., Hammock, B. D. Mass spectrometry-based metabolomics. Mass spectrometry reviews. 26 (1), 51-78 (2007).
- Hajjaj, H., Blanc, P. J., Goma, G., François, J. Sampling techniques and comparative extraction procedures for quantitative determination of intra- and extracellular metabolites in filamentous fungi. FEMS Microbiology Letters. 164 (1), 195-200 (1998).
- Ruijter, G. J. G., Visser, J. Determination of intermediary metabolites in Aspergillus niger. Journal of Microbiological Methods. 25 (3), 295-302 (1996).
- Mailinger, W., Baltes, M., Theobald, U., Reuss, M., Rizzi, M. In vivo analysis of metabolic dynamics in Saccharomyces cerevisiae: I. Experimental observations. Biotechnology and Bioengineering. 55 (2), 305-316 (1997).
- Dunn, W. B., et al. Mass appeal: metabolite identification in mass spectrometry-focused untargeted metabolomics. Metabolomics. 9 (1), 44-66 (2013).
- Huang, T., Toro, M., Lee, R., Hui, D. S., Edwards, J. L. Multi-functional derivatization of amine, hydroxyl, and carboxylate groups for metabolomic investigations of human tissue by electrospray ionization mass spectrometry. Analyst. 143 (14), 3408-3414 (2018).
- Huang, T., Armbruster, M. R., Coulton, J. B., Edwards, J. L. Chemical Tagging in Mass Spectrometry for Systems Biology. Analytical Chemistry. 91 (1), 109-125 (2019).
- Yang, W. C., Sedlak, M., Regnier, F. E., Mosier, N., Ho, N., Adamec, J. Simultaneous quantification of metabolites involved in central carbon and energy metabolism using reversed-phase liquid chromatography-mass spectrometry and in vitro 13C labeling. Analytical Chemistry. 80 (24), 9508-9516 (2008).
- Jannasch, A., Sedlak, M., Adamec, J., Metz, T. O. Quantification of Pentose Phosphate Pathway (PPP) Metabolites by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry (LC-MS). Metabolic Profiling. Methods in Molecular Biology 708 (Methods and Protocols). , 159-171 (2011).
- Luo, B., Groenke, K., Takors, R., Wandrey, C., Oldiges, M. Simultaneous determination of multiple intracellular metabolites in glycolysis, pentose phosphate pathway, and tricarboxylic acid cycle by liquid chromatography-mass spectrometry. Journal of Chromatography A. 1147 (2), 153-164 (2007).
