一定の流れの原発性ヒト内皮細胞の肺炎球菌感染

肺炎球菌感染症の病因は、プラスミノーゲンおよびVWF1、2^{などのヒト止血症の細胞外マトリックス化合物および成分の多様性との多面的相互作用によって特徴付けられます。3,4},^5,6,7,8.マルチドメイン糖タンパク質VWFは、血管血栓^形成9の部位における血栓細胞リクルートおよびフィブリンの組み込みを媒食することにより、バランスのとれた止血症の主要な調節体として機能する。出血制御および創傷治癒のための機能的、活性VWFの重要性は、フォン・ヴィレブランド病、一般的な遺伝性出血^性疾患10によって実証される。

球状VWFは、最大14.0μg/mL^11、10の濃度でヒト血液系を循環する。血管損傷に対して、内皮ワイベルパレードボディ(WBP)によるVWFの局所放出は著しく増加^{する11、12}である。これまでの研究では、肺炎球菌がヒト内皮細胞に付着し、細孔形成毒素肺炎の産生が発光VWF分^泌13を有意に刺激することが示されている。血流の流体力学的力は、メカノレスポンシブVWFドメインの構造開口部を誘導する。10 dyn/cm^の流量で、VWFは、サブ子宮^皮10、12に取り付けられたままの長さ数百マイクロメートルまでの長いタンパク質ストリングに多量化する。

肺炎球菌と内皮表面との相互作用においてせん断応力下で発生する多量体化VWF弦の機能を理解するために、マイクロ流体ベースの細胞培養感染アプローチが確立された。ソフトウェア制御空気圧ポンプシステムを備えたマイクロ流体装置を使用した。これにより、定義された流量を有する細胞培養培地の連続的な単方向再循環が可能にされた。それによって、システムは、特殊なチャネルスライド内に取り付けられたままの内皮細胞の表面に定義されたせん断応力を適用した。このアプローチにより、定義された一定の流れ条件下で分化した内皮細胞にVWF弦が生成される、ヒト血管系の血流中のせん断力のシミュレーションが可能となった。この目的のために、内皮細胞を特定のチャネルスライドで培養した(材料表参照)。マイクロ流体ポンプシステムは、コンフルエント内皮細胞層上の拡張VWF弦の形成に必要な高度に定義され、制御されたせん断応力状況を提供しました。ヒスタミン補充によりヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)を収縮的に増殖させたヒト臍静脈内皮細胞のVWF分泌の刺激後、弦形成は10dyn/cm2のせん断応力(・△)を加えることによって誘導された。せん断応力は、細胞層に作用する力として定義されます。コーニッシュetに従って計算される。al.¹⁴方程式 1:

ここで、dyn/cm²のせん断応力、ε = 粘度(dyn∙s)/cm^2、h= チャネル高さの半分、w = チャネル幅の半分、および Φ = 流量 (mL/min) です。

方程式 1 の結果は、使用するさまざまなスライドの高さと幅によって異なります (「材料表」を参照)。本研究では、0.4μmのルアーチャンネルスライドを用い、チャンバースライド係数131.6を用いた(式2参照)。

37°Cでの媒体の粘度は0.0072 dyn∙s/cm²であり、10dyn/cm²のせん断応力を使用した。その結果、流量は10.5mL/分になります(式3を参照)。

ここで、宿主血管系における細菌感染機構の調査及び可視化のための単方向層流システムを用いた微小流体細胞培養手順の適応及び進歩について詳細に説明する。内皮層上のVWF弦の生成は、連続的で安定したせん断^応力15を適用することができる他のポンプシステムを使用することによって刺激することができる。

VWF弦形成の流れと刺激に合流する一次内皮細胞の培養後、赤色蛍光タンパク質(RFP)16を発現する肺炎球^菌16を、一定の顕微鏡制御下で内皮細胞層に添加した。内皮細胞表面のVWF弦への細菌の付着は、VWF特異的蛍光標識抗体を用いて顕微鏡的に可視化し、最大3時間リアルタイムで監視した。このアプローチにより、血管内皮への細菌付着を促進する接着補因子としてのVWFの役割^が8と判定された。

タンパク質分泌と立体構造変化の顕微鏡的可視化に加えて、この方法は、細菌感染プロセスの単一ステップをリアルタイムで監視し、異なる時点での付着菌の量を定量化するために使用することができる感染。特定のソフトウェア制御ポンプシステムはまた、内皮細胞を定義された一定の流れ条件で数日間培養する可能性を提供し、定義されたパルス媒体フローインキュベーションを可能にする。さらに、このメソッドは、異なるセルタイプを使用して適用することができます。染色プロトコルを適応させることは、真核細胞に内部化された細菌の検出および可視化も可能にする。

この原稿では、病態生理学的プロセスの効率的かつ汎用的な特性評価のための定義された、信頼性が高く、再現可能なアプローチとして使用できるこの高度な実験プロトコルについて説明します。