זיהום פנאומטי של תאים אנושיים ראשוניים של האדם בזרימה קבועה

הפתוגנזה של זיהומים פנאומטי מאופיין באינטראקציה רבת-פנים עם מגוון של תרכובות מטריצות ורכיבים של המטאוסטזיס האנושי, כגון פלמיננוגן ו vwf^{1,2, . שלוש,ארבע,חמש,שש,שבע, שמונה} רב התחומים גליקופרוטאין VWF משמש כרגולטור מפתח של הומוסטאזיס מאוזנת על ידי גיוס thrombocyte מדיה ו התאגדות פיאין באתר של היווצרות כלי דם הטרובוס⁹. החשיבות של הפונקציונלי, VWF פעיל עבור שליטה דימום וריפוי הפצע הוא הפגינו על ידי המחלה של פון Willebrand, הפרעת דימום משותף הפרעה¹⁰.

כדורי vwf מסחררת במערכת הדם האנושי בריכוז של עד 14.0 μg/mL^11,10. בתגובה לפציעה וסקולרית, שחרורו המקומי של vwf על ידי הגופים האלה של weibel palade (wbp) גדל במידה ניכרת^11,12. מחקרים קודמים מראים כי הדבקות האנטי-קוקוס לתאי האנדותל של האדם והייצור של הנקבוביות היוצרות משאבה משמעותית מעוררת באופן משמעותי את הפרשת הלומיאל (VWF)¹³. הכוחות ההידרודינמיים של זרימת הדם גורמים לפתיחת מבנה של תחומים VWF מכנימים. בקצב זרימה של 10 דינמיקה/ס”מ² vwf multimerizes למחרוזות חלבון ארוך של עד כמה מיקרומטר באורך הנותרים מחוברים subאנדותל^10,12.

כדי להבין את הפונקציה של מחרוזות VWF מולטימzed שנוצר תחת לחץ הטיה באינטראקציה של אבקת הקוקוס עם משטח אנדותל, מבוססי microfluidic מבוסס תרבות התא הגישה זיהום הוקמה. התקן מיקרופלואידיג עם מערכת משאבת הלחץ על התוכנה בקרת האוויר שימש. פעולה זו איפשרה הפעלת מבנה חד-כיווני ורציף של מדיום תרבות התא עם קצב זרימה מוגדר. ובכך, המערכת החלה להדגיש הטיה מוגדרת על פני השטח של תאים אנדותל, אשר נשאר מחובר בתוך שקופיות הערוץ המקצועית. גישה זו אפשרה את הסימולציה של כוח ההטיה בתוך זרם הדם של מערכת כלי הדם של האדם, שבו מחרוזות VWF מופקים על תאים אנדותל מובחנים בתנאי זרימה קבועים מוגדרים. לצורך זה, תאי האנדותל מעובדים בשקופיות מסוימות של ערוצים (ראו טבלת חומרים), שהותאמה לניתוחים מיקרוסקופיים במהלך הזרימה. מערכת המשאבה microflu, מספק את המצב מאוד מוגדר ומבוקר לחץ להטות הנדרש עבור היווצרות של מחרוזות VWF המורחבת על שכבת התאים שוטפת של הרשת. לאחר הגירוי של VWF-הפרשה של האדם בוגר הטבור וריד בתאי הטבורי (HUVEC) על ידי תוספי היסטמין, היווצרות מחרוזת המושרה על ידי החלת מתח הטיה (ԏ) של 10 דינמיקה/cm². לחץ ההטיה מוגדר ככוח הפועל על שכבת התא. הוא מחושב בקירוב על פי הקורנית. אל¹⁴ עם משוואה 1:

כאשר ԏ = להטות את המתח בדינמיקה/cm², η = צמיגות ב (דינמיקה ∙ s)/cm², h = מחצית גובה הערוץ, w = חצי רוחב הערוץ, ו Φ = שיעור flowrate-mL/min.

התוצאה של משוואה 1 תלויה בגבהים וברוחב השונים של השקופיות השונות המשמשות (ראה טבלת חומרים). במחקר זה שקופית ערוץ luer של 0.4 יקרומטר והתוצאה היא גורם שקופית קאמרית של 131.6 שימש (ראה נוסחה 2).

צמיגות של המדיום ב 37 ° c הוא 0.0072 דינמיקה ∙ s/cm ² ו להטות את הלחץ של 10 דינמיקה/cm ² שימש. זה הביא לקצב הזרימה של 10.5 mL/min (ראה פורמולה 3).

כאן, הסתגלות וקידום של הליך מיקרופלואידיג תא culturing באמצעות מערכת זרימה חד-כיוונית למינארי עבור החקירה ויזואליזציה של מנגנוני זיהום חיידקי בתוך המארח המארחים מתואר בפירוט. הדור של מחרוזות VWF על שכבות אנדותל יכול להיות גם מגורה באמצעות מערכות משאבה אחרות, כי הם מסוגלים להחיל לחץ מתמשך ויציב להטות¹⁵.

לאחר הטיפוח של תאי האנדותל הראשוניים למפגש בזרימה וגירוי של היווצרות מחרוזות VWF, הבעת הופעת חלבון פלואורסצנט אדום (RFP)¹⁶ נוספו לשכבת התא האנדותל תחת שליטה מיקרוסקופית מתמדת. ההחזקה של חיידקים כדי vwf מחרוזות על פני השטח של תאים אנדותל היה מאכל דמיין והפיקוח עד שלוש שעות בזמן אמת על ידי שימוש ב-vwf ספציפי נוגדנים מתויג-פלורסנט. עם גישה זו, התפקיד של VWF כמו קופקטור הדבקה לקידום ההחזקה החיידקית של כלי הדם אנדותל היה נחוש⁸.

בנוסף להדמיה המיקרוסקופית של הפרשת החלבון והשינויים השונים, ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לפקח על צעדים בודדים של תהליכי זיהום חיידקי בזמן אמת, כדי לכמת את כמות החיידקים המצורפים בנקודות זמן שונות של זיהום. מערכת ספציפית מבוקרת תוכנה מספקת גם את האפשרות לתרבות התאים האנדותל בתנאי זרימה קבועה מוגדר למשך עד מספר ימים ומאפשר הדגירה פעמו זרימה בינונית. כמו-כן, ניתן להחיל שיטה זו באמצעות סוגי תאים שונים. התאמת פרוטוקול הצביעת גם מאפשרת איתור והדמיה של חיידקים הפנימו לתוך תאים איקריוטית.

כתב יד זה מתאר את הפרוטוקול הניסיוני המתקדם שניתן להשתמש בו כגישה מוגדרת, אמינה וניתנת ליישום לאפיון יעיל ותכליתי של תהליכים פתופסלוגיים.