Pneumokokken-Infektion von primären humanen Endothelzellen im konstanten Fluss

Die Pathogenese von Pneumokokken-Infektionen ist durch eine facettenreiche Wechselwirkung mit einer Vielzahl von extrazellulären Matrixverbindungen und Komponenten der menschlichen Hämostase, wie Plasminogen und VWF^{1,2, 3,4,5,6,7,8}. Das Multidomain-Glykoprotein VWF dient als Hauptregulator einer ausgewogenen Hämostase durch Vermittlung von Thrombozytenrekrutierung und Fibrin-Inkorporation am Standort der vaskulären Thrombusbildung⁹. Wie wichtig funktionelles, aktives VWF für die Blutungskontrolle und Wundheilung ist, zeigt die von Willebrand-Krankheit, eine häufige erbliche Blutungsstörung¹⁰.

Globular VWF zirkuliert im menschlichen Blutsystem in einer Konzentration von bis zu 14,0 g/ml^11,10. Als Reaktion auf Gefäßverletzungen ist die lokale Freisetzung von VWF durch endotheliale Weibel Palade Bodies (WBP) deutlich erhöht^11,12. Frühere Studien zeigen, dass die Pneumokokken-Bindung an menschliche Endothelzellen und seine Produktion des porenbildenden Toxins Pneumolysin die luminale VWF-Sekretion signifikant stimuliert¹³. Die hydrodynamischen Kräfte des Blutflusses induzieren eine strukturelle Öffnung der mechanoreagierenden VWF-Domänen. Bei Durchflussraten von 10 Dyn/cm² vermehrt sich der VWF zu langen Proteinsaiten von bis zu mehreren hundert Mikrometern Länge, die am Subendothel^10,12befestigt bleiben.

Um die Funktion von multimerisierten VWF-Strings zu verstehen, die unter Scherspannung im Zusammenspiel von Pneumokokken mit der endotheliaalen Oberfläche erzeugt werden, wurde ein mikrofluidischer Zellkulturinfektionsansatz etabliert. Es wurde ein mikrofluidisches Gerät mit einem softwaregesteuerten Luftdruckpumpensystem eingesetzt. Dies ermöglichte eine kontinuierliche, unidirektionale Rezirkulation des Zellkulturmediums mit einer definierten Durchflussrate. Dabei wendete das System eine definierte Scherspannung auf die Oberfläche von Endothelzellen an, die in speziellen Kanalschlitten befestigt blieben. Dieser Ansatz ermöglichte die Simulation der Scherkraft innerhalb des Blutstroms des menschlichen Gefäßsystems, bei der VWF-Strings auf differenzierten Endothelzellen unter definierten konstanten Strömungsbedingungen erzeugt werden. Zu diesem Zweck wurden die Endothelzellen in spezifischen Kanalgleitern (siehe Materialtabelle) kultiviert, die für mikroskopische Analysen während des Durchflusses angepasst wurden. Das mikrofluidische Pumpensystem lieferte die hochdefinierte und kontrollierte Scherspannungssituation, die für die Bildung von verlängerten VWF-Strings auf der konfluenten Endothelzellschicht erforderlich ist. Nach der Stimulation der VWF-Sekretion von konfluent gewachsenen menschlichen Nabelvenenenen-Endothelzellen (HUVEC) durch Histamin-Supplementierung wurde die Saitenbildung durch Anwendung einer Scherspannung von 10 Dyn/cm²induziert. Die Scherspannung ist definiert als die Kraft, die auf die Zellschicht einwirkt. Es wird ungefähr nach Cornish et berechnet. 14 mit Gleichung 1:

Wobei die Scherspannung in Dyn/cm², b = Viskosität in (dyn)/cm², h = die Hälfte der Kanalhöhe, w = die Hälfte der Kanalbreite und die Durchflussrate in mL/min.

Das Ergebnis von Gleichung 1 hängt von den verschiedenen Höhen und Breiten der verschiedenen verwendeten Folien ab (siehe Materialtabelle). In dieser Studie wurde ein Luer-Kanalschlitten von 0,4 m verwendet, was zu einem Kammerschieberfaktor von 131,6 führte (siehe Formel 2).

Viskosität des Mediums bei 37 °C beträgt 0,0072 Dyn/cm2 und es wurde eine Scherspannung von 10 Dyn/cm2 verwendet. Dies führte zu einem Durchfluss von 10,5 ml/min (siehe Formel 3).

Hier wird die Anpassung und Weiterentwicklung eines mikrofluidischen Zellkultivierungsverfahrens mit einem unidirektionalen laminaren Strömungssystem zur Untersuchung und Visualisierung bakterieller Infektionsmechanismen in der Wirtsvaskulatur ausführlich beschrieben. Die Erzeugung von VWF-Strings auf Endothelschichten kann auch durch andere Pumpensysteme angeregt werden, die eine kontinuierliche und stetige Scherspannung¹⁵auftragen können.

Nach der Kultivierung von primären Endothelzellen zur Zusammenflussung und Stimulation der VWF-Stringbildung wurden pneumokokken, die rotes Fluoreszenzprotein (RFP)¹⁶ exezieren, der Endothelzellschicht unter konstanter mikroskopischer Kontrolle zugesetzt. Die Befestigung von Bakterien an VWF-Saiten an der Oberfläche von Endothelzellen wurde mikroskopisch visualisiert und mit VWF-spezifischen fluoreszierenden Antikörpern bis zu drei Stunden in Echtzeit überwacht. Mit diesem Ansatz wurde die Rolle von VWF als Adhäsionskofaktor zur Förderung der bakteriellen Bindung an das vaskuläre Endothel bestimmt⁸.

Neben der mikroskopischen Visualisierung von Proteinsekretion und Konformationsveränderungen könnte diese Methode eingesetzt werden, um einzelne Schritte bakterieller Infektionsprozesse in Echtzeit zu überwachen und die Menge der angeschlossenen Bakterien zu verschiedenen Zeitpunkten von ansteckung. Das spezifische softwaregesteuerte Pumpensystem bietet zudem die Möglichkeit, die Endothelzellen in definierten konstanten Strömungsbedingungen bis zu mehreren Tagen zu kultitoren und ermöglicht eine definierte gepulste mittlere Strömungsinkubation. Darüber hinaus kann diese Methode mit verschiedenen Zelltypen angewendet werden. Die Anpassung des Färbeprotokolls ermöglicht auch die Detektion und Visualisierung von Bakterien, die in eukaryotische Zellen verinnerlicht sind.

Dieses Manuskript beschreibt dieses fortschrittliche experimentelle Protokoll, das als definierter, zuverlässiger und reproduzierbarer Ansatz für eine effiziente und vielseitige Charakterisierung pathophysiologischer Prozesse verwendet werden kann.