Un método de montaje en capas para la microscopía confocal de lapso de tiempo extendido de embriones enteros de pez cebra
Summary
Este artículo describe un método para montar embriones frágiles de pez cebra para microscopía confocal de lapso de tiempo extendido. Este método de bajo costo es fácil de realizar utilizando platos regulares de microscopía de fondo de vidrio para obtener imágenes en cualquier microscopio invertido. El montaje se realiza en capas de agarosa a diferentes concentraciones.
Abstract
La dinámica de desarrollo puede ser seguida por una microscopía confocal de lapso de tiempo de embriones de pez cebra transgénicos vivos que expresan fluorescencia en tejidos o células específicos. Una dificultad con el desarrollo de embriones enteros es que los embriones de pez cebra crecen sustancialmente en longitud. Cuando se monta como se hace regularmente en 0.3-1% baja agarosa de fusión, la agarosa impone restricción de crecimiento, dando lugar a distorsiones en el cuerpo del embrión blando. Sin embargo, para realizar una microscopía confocal de lapso de tiempo, el embrión debe ser inmovilizado. Este artículo describe un método de montaje en capas para embriones de pez cebra que restringen la motilidad de los embriones mientras permiten el crecimiento sin restricciones. El montaje se realiza en capas de agarosa a diferentes concentraciones. Para demostrar la usabilidad de este método, el desarrollo vascular, neuronal y muscular de embriones enteros se realizó en peces transgénicos durante 55 horas consecutivas. Este método de montaje se puede utilizar para obtener imágenes fáciles y de bajo costo de embriones enteros de peces cebra utilizando microscopios invertidos sin necesidad de moldes o equipos especiales.
Introduction
El pez cebra ha sido durante mucho tiempo un organismo modelo para la biología del desarrollo, y la microscopía es el principal método para visualizar el desarrollo embrionario. Las ventajas de utilizar embriones de pez cebra para estudios de desarrollo incluyen pequeño tamaño, claridad óptica, desarrollo rápido y alta fecundidad de los peces adultos. La generación de líneas transgénicas de peces cebra que expresan fluorescencia en ciertos tejidos o células han permitido una visualización directa del desarrollo de tejidos de maneras no posibles con animales vertebrados más grandes. En combinación con la microscopía de lapso de tiempo, los detalles y la dinámica del desarrollo del tejido se pueden estudiar fácilmente.
Una dificultad con el desarrollo de peces cebra por imágenes es que los embriones crecen sustancialmente en longitud; el embrión extiende su longitud cuatro veces dentro de los primeros 3 días de vida1. Además, el cuerpo del embrión temprano es suave, y fácilmente se distorsiona si el crecimiento está restringido. Sin embargo, para realizar una microscopía confocal, el embrión debe estar inmovilizado. Para mantener los embriones en una posición fija para la toma de imágenes confocales de lapso de tiempo, se anestesian regularmente y se montan en agarosa de fusión baja del 0,3-1%. Esto tiene la ventaja de permitir cierto crecimiento durante la toma de imágenes durante un cierto período de tiempo, mientras que restringe los movimientos del embrión. Partes del embrión se pueden imaginar eficientemente así. Sin embargo, cuando se utiliza este método para la toma de imágenes de todo el embrión durante períodos de tiempo prolongados, se observan distorsiones debido al crecimiento restringido causado por la agarosa. Por lo tanto, se requieren otros métodos de montaje. Kaufmann y sus colegas han descrito un montaje alternativo de embriones de pez cebra para la microscopía de láminas ligeras, como la microscopía de iluminación selectiva de plano (SPIM), montando los embriones en tubos de etileno propileno fluorado (FEP) que contienen bajas concentraciones de agarosa o metilcelulosa2. Esta técnica produce una excelente visualización de la embriogénesis a lo largo del tiempo. Schmid et al. describen el montaje de hasta seis embriones en agarosa en tubos FEB para la microscopía de hoja de luz3 proporcionando visualización de varios embriones en una sesión de imágenes. Se han utilizado moldes para crear matrices de embriones para un montaje eficiente de un mayor número de embriones4. Masselkink et al. han construido moldes de plástico impresos en 3D que se pueden utilizar para hacer moldes de silicio en los que se pueden colocar embriones de pez cebra en diferentes etapas, lo que permite el montaje en una posición constante para la toma de imágenes, incluida la imagen confocal5. La impresión 3D también se ha utilizado para hacer moldes para el posicionamiento consistente de embriones de pez cebra en formato de 96 pozos6. Algunos moldes se personalizan para ciertas etapas y pueden no permitir un crecimiento sin restricciones durante largos períodos de tiempo, mientras que otros moldes son más flexibles. Recientemente, Weijts et al. publicaron el diseño y la fabricación de un plato de cuatro pozos para la toma de imágenes en vivo de embriones de pez cebra7. En este plato, la cola y el tronco de los embriones de pescado anestesiados se colocan manualmente bajo un techo de silicona transparente unido justo encima de un cristal de cubierta para formar un bolsillo. El embrión se fija entonces en esta posición mediante la adición de 0,4% de agarosa. Este montaje permite la toma de imágenes de la parte posterior de unos 2 mm de largo (tronco y cola) del embrión, y como se pueden montar hasta 12 embriones por pozo, el método permite la toma de imágenes de múltiples muestras. Del mismo modo, Hirsinger y Steventon presentaron recientemente un método donde la cabeza del pez está montada en agarose, mientras que la cola puede crecer libremente, y este método también facilita eficientemente la toma de imágenes del tronco y la región de la cola del embrión8.
Este artículo describe un método de montaje en capas para embriones de pez cebra que restringen los movimientos de los embriones mientras permiten un crecimiento sin restricciones. Las ventajas de este método de montaje son que es un método de bajo costo, rápido y fácil para montar embriones de varias etapas para la toma de imágenes utilizando cualquier microscopio invertido. El montaje permite imágenes a largo plazo de todo el cuerpo (cabeza, tronco y cola) durante el desarrollo embrionario. Para mostrar la usabilidad de este método, se realizó la imagen del desarrollo vascular, neuronal y muscular de embriones enteros en peces transgénicos. Dos embriones por sesión, a dos longitudes de onda en 3D fueron representados por microscopía de lapso de tiempo durante 55 horas consecutivas para representar películas de desarrollo de tejido.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aquí se describe un método de montaje para la microscopía confocal de lapso de tiempo extendido de embriones enteros de peces cebra. El paso más crítico para el método de montaje es identificar la concentración óptima de agarosa que permitirá el crecimiento sin restricciones del embrión del pez cebra, y al mismo tiempo mantener los embriones en una posición completamente fija para la toma de imágenes confocales. Debido a que la concentración óptima de agarosa es muy estrecha, este valor es muy sensible a lo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Albert Pan y Arndt Sieakmann por los regalos de pescado transgénico. Agradecemos a Koichi Kawakami en el Instituto Nacional de Genética, el Proyecto Nacional de Biorecursos del Ministerio de Educación, Cultura, Deportes, Ciencia y Tecnología de Japón por el regalo del pez cebra transgénico HGn39b. También agradecemos a Fatima Merchant y Kathleen Gajewski por su ayuda en microscopía confocal, y a Tracey Theriault por fotografías.
Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Nacional de Ciencias de la Salud Ambiental de los Institutos Nacionales de Salud (número de subvención P30ES023512 y número de contrato HHSN273201500010C). SU fue apoyada por una beca del programa Keck Computational Cancer Biology (Gulf Coast Consortia CPRIT grant RP140113) y por Hugh Roy y Lillie Endowment Fund. La Fundación Robert A. Welch (E-0004) contó con el apoyo de j-o G.
Materials
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| Micro cover glass 22×22 mm | VWR | 48366 067 | |
| Leica DMi8 fluorescence microscope | Leica | NA | |
| LAS X software | Leica | NA | Microscope software |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Nikon A1S confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | NA | |
| Nikon NIS AR Version 4.40 | Nikon Instruments Inc. | NA | Microscope software |
References
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nature Communications. 4, 2207 (2013).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
- Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).
- Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing. BMC Biotechnology. 14, 36 (2014).
- Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. A Four-Well Dish for High-Resolution Longitudinal Imaging of the Tail and Posterior Trunk of Larval Zebrafish. Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).
- Hirsinger, E., Steventon, B. A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development. Journal of Visualized Experiment. (119), (2017).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiment. (69), e4196 (2012).
- McCollum, C. W., et al. Embryonic exposure to sodium arsenite perturbs vascular development in zebrafish. Aquatic Toxicology. 152, 152-163 (2014).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).
- Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
- Nagayoshi, S., et al. Insertional mutagenesis by the Tol2 transposon-mediated enhancer trap approach generated mutations in two developmental genes: tcf7 and synembryn-like. Development. 135 (1), 159-169 (2008).
- Huang, W. C., et al. Combined use of MS-222 (tricaine) and isoflurane extends anesthesia time and minimizes cardiac rhythm side effects in adult zebrafish. Zebrafish. 7 (3), 297-304 (2010).
- Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish. Laboratory Animal (NY). 35 (9), 41-47 (2006).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), 0134005 (2015).
