Um método de montagem em camadas para a microscopia confocal de lapso de tempo prolongado de embriões zebrafish inteiros
Summary
Este artigo descreve um método para montar embriões frágeis do zebrafish para a microscopia confocal prolongada do tempo-lapso. Este método de baixo custo é fácil de executar usando pratos regulares de microscopia com fundo de vidro para imagens em qualquer microscópio invertido. A montagem é realizada em camadas de agarose em diferentes concentrações.
Abstract
A dinâmica do desenvolvimento pode ser seguida pela microscopia confocal do time-lapse de embriões transgênicos vivos do zebrafish que expressam a fluorescência em tecidos ou em pilhas específicos. Uma dificuldade com o desenvolvimento de embriões inteiros da imagem latente é que os embriões do zebrafish crescem substancialmente no comprimento. Quando montada como feito regularmente em 0,3-1% de baixa agarose de raço, a agarose impõe restrição de crescimento, levando a distorções no corpo de embriões moles. No entanto, para realizar microscopia confocal time-lapse, o embrião deve ser imobilizado. Este artigo descreve um método de montagem em camadas para embriões de zebrafish que restringem a motilidade dos embriões, permitindo o crescimento irrestrito. A montagem é realizada em camadas de agarose em diferentes concentrações. Para demonstrar a usabilidade deste método, o desenvolvimento vascular, neuronal e do músculo inteiro do embrião foi imaged em peixes transgémicos por 55 horas consecutivas. Este método de montagem pode ser usado para imagens fáceis e de baixo custo de embriões inteiros de zebrafish usando microscópios invertidos sem requisitos de moldes ou equipamentos especiais.
Introduction
O zebrafish tem sido um organismo modelo para a biologia do desenvolvimento, e a microscopia é o método principal para visualizar o desenvolvimento embrionário. As vantagens do uso de embriões de zebrafish para estudos de desenvolvimento incluem pequeno tamanho, clareza óptica, desenvolvimento rápido e alta fecundidade dos peixes adultos. A geração de linhas transgênicas de zebrafish expressando fluorescência em certos tecidos ou células permitiu uma visualização direta do desenvolvimento de tecidos de maneiras não possíveis com animais vertebrados maiores. Em combinação com a microscopia de lapso de tempo, detalhes e dinâmicas do desenvolvimento do tecido podem ser prontamente estudados.
Uma dificuldade com o desenvolvimento do zebrafish da imagem latente é que os embriões crescem substancialmente no comprimento; o embrião estende seu comprimento quatro vezes nos primeiros 3 dias de vida1. Além disso, o corpo do embrião precoce é macio e facilmente se torna distorcido se o crescimento for restrito. No entanto, para realizar microscopia confocal, o embrião deve ser imobilizado. Para manter os embriões em posição fixa para imagens confocais de lapso de tempo, eles são regularmente anestesiados e montados em 0,3-1% de baixa fusão agarose. Isto tem a vantagem de permitir algum crescimento durante a imagem latente por um determinado período de tempo, ao restringir movimentos do embrião. Partes do embrião podem ser imagemdas de forma eficiente assim. No entanto, ao utilizar este método de imagem de todo o embrião por longos períodos de tempo, as distorções são observadas devido ao crescimento restrito causado pela agarose. Assim, outros métodos de montagem são necessários. Kaufmann e seus colegas descreveram uma montagem alternativa de embriões de zebrafish para microscopia de folha de luz, como microscopia seletiva de iluminação plana (SPIM), montando os embriões em tubos de etileno fluorado (FEP) contendo baixas concentrações de agarose ou metilcelulose2. Esta técnica produz uma visualização soberba de embriogênese ao longo do tempo. Schmid et al. descrevem a montagem de até seis embriões em agarose em tubos feb para microscopia de folha de luz3 fornecendo visualização de vários embriões em uma sessão de imagem. Os moldes foram usados para criar disposições do embrião para a montagem eficiente de um número maior de embriões4. Masselkink et al. construíram moldes plásticos impressos em 3D que podem ser usados para fazer moldes de silício em que embriões de zebrafish em diferentes estágios podem ser colocados, permitindo a montagem em uma posição constante para imagens, incluindo imagens confocais5. Impressão 3D também tem sido usada para fazer moldes para o posicionamento consistente de embriões zebrafish em 96 bem formato6. Alguns moldes são personalizados para determinadas fases e não podem permitir o crescimento irrestrito por longos períodos de tempo, enquanto outros moldes são mais flexíveis. Recentemente, Weijts et al. publicou o projeto e fabricação de um prato de quatro poços para imagens ao vivo de embriões zebrafish7. Neste prato, a cauda e o tronco de embriões de peixeanestesiados são colocados manualmente um telhado de silicone claro ligado logo acima de um copo de cobertura para formar um bolso. O embrião é então fixado nesta posição pela adição de 0,4% agarose. Esta montagem permite a imagem latente da parte posterior de aproximadamente 2 milímetros de comprimento (tronco e cauda) do embrião, e como até 12 embriões podem ser montados por poço, o método permite a imagem latente de amostras múltiplas. Da mesma forma, Hirsinger e Steventon apresentaram recentemente um método onde a cabeça do peixe é montada em agarose, enquanto a cauda pode crescer livremente, e este método também facilita eficientemente a imagem do tronco e da região da cauda do embrião8.
Este artigo descreve um método de montagem em camadas para embriões de zebrafish que restringem os movimentos dos embriões, permitindo um crescimento irrestrito. As vantagens deste método de montagem são que é um método de baixo custo, rápido e fácil de montar embriões de várias fases para imagens usando qualquer microscópio invertido. A montagem permite a imagem latente a longo prazo do corpo inteiro (cabeça, tronco e cauda) durante o desenvolvimento do embrião. Para mostrar a usabilidade deste método, o desenvolvimento vascular, neuronal e do músculo inteiro do embrião foi imaged em peixes transgénicas. Dois embriões por sessão, em dois comprimentos de onda em 3D foram imageados pela microscopia do time-lapse por 55 horas consecutivas para render filmes do desenvolvimento do tecido.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um método de montagem para a microscopia confocal de lapso de tempo prolongado de embriões inteiros de zebrafish é descrito aqui. O passo mais crítico para o método de montagem é identificar a concentração ideal de agarose que permitirá o crescimento irrestrito do embrião de zebrafish e, ao mesmo tempo, manter os embriões em uma posição completamente fixa para imagens confocais. Como a concentração ideal de agarose é muito estreita, esse valor é muito sensível aos erros na medição do peso da agarose e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Albert Pan e Arndt Sieakmann por presentes de peixe transgênico. Agradecemos Koichi Kawakami no Instituto Nacional de Genética, o Projeto Nacional de BioResource do Ministério da Educação, Cultura, Esportes, Ciência e Tecnologia do Japão para o dom do zebrafish transgênico HGn39b. Agradecemos também a Fátima Merchant e Kathleen Gajewski pela assistência na microscopia confocal e a Tracey Theriault por fotografias.
Este trabalho foi apoiado por subvenções do Instituto Nacional de Ciências da Saúde Ambiental dos Institutos Nacionais de Saúde (número de subvenção P30ES023512 e número de contrato HHSN273201500010C). A SU foi apoiada por uma bolsa do programa Keck Computational Cancer Biology (Gulf Coast Consortia CPRIT grant RP140113) e por Hugh Roy e Lillie Endowment Fund. J-Å G foi apoiado pela Fundação Robert A. Welch (E-0004).
Materials
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| Micro cover glass 22×22 mm | VWR | 48366 067 | |
| Leica DMi8 fluorescence microscope | Leica | NA | |
| LAS X software | Leica | NA | Microscope software |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Nikon A1S confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | NA | |
| Nikon NIS AR Version 4.40 | Nikon Instruments Inc. | NA | Microscope software |
References
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