Une méthode de montage en couches pour la microscopie confocale de temps-lapse prolongée des embryons entiers de poisson zèbre
Summary
Cet article décrit une méthode pour monter les embryons fragiles de poisson zèbre pour la microscopie confocale de time-lapse prolongée. Cette méthode à faible coût est facile à exécuter en utilisant des plats de microscopie à fond de verre réguliers pour l’imagerie sur n’importe quel microscope inversé. Le montage est effectué en couches d’agarose à différentes concentrations.
Abstract
La dynamique du développement peut être suivie d’une microscopie confocale en accéléré d’embryons transgéniques vivants de poissons zèbres exprimant la fluorescence dans des tissus ou des cellules spécifiques. Une difficulté avec le développement entier d’embryon d’imagerie est que les embryons de poisson zèbre se développent sensiblement dans la longueur. Lorsqu’elle est montée comme régulièrement fait dans 0.3-1% agarose basse de fonte, l’agarose impose la restriction de croissance, menant aux distorsions dans le corps mou d’embryon. Pourtant, pour effectuer une microscopie confocale en time-lapse, l’embryon doit être immobilisé. Cet article décrit une méthode de montage en couches pour les embryons de poisson zèbre qui limitent la motilité des embryons tout en permettant la croissance sans restriction. Le montage est effectué en couches d’agarose à différentes concentrations. Pour démontrer la facilité d’utilisation de cette méthode, le développement vasculaire, neuronal et musculaire d’embryon entier a été imaged dans les poissons transgéniques pendant 55 heures consécutives. Cette méthode de montage peut être utilisée pour l’imagerie facile et peu coûteuse d’embryons entiers de poisson zèbre à l’aide de microscopes inversés sans exigences de moules ou d’équipement spécial.
Introduction
Le poisson zèbre a longtemps été un organisme modèle pour la biologie du développement, et la microscopie est la principale méthode pour visualiser le développement embryonnaire. Les avantages de l’utilisation d’embryons de poisson zèbre pour les études de développement comprennent la petite taille, la clarté optique, le développement rapide et la fécondité élevée des poissons adultes. La génération de lignées transgéniques de poissons zèbres exprimant la fluorescence dans certains tissus ou cellules a permis une visualisation directe du développement des tissus d’une manière qui n’est pas possible avec les plus grands vertébrés. En combinaison avec la microscopie time-lapse, les détails et la dynamique du développement des tissus peuvent être facilement étudiés.
Une difficulté avec le développement de poisson zèbre d’imagerie est que les embryons se développent sensiblement dans la longueur ; l’embryon étend sa longueur quatre fois dans les 3 premiers jours de la vie1. En outre, le corps de l’embryon précoce est mou, et devient facilement déformé si la croissance est limitée. Pourtant, pour effectuer une microscopie confocale, l’embryon doit être immobilisé. Pour maintenir les embryons dans une position fixe pour l’imagerie confocale en accéléré, ils sont régulièrement anesthésiés et montés en agarose à faible fonte de 0,3 à 1 %. Cela a l’avantage de permettre une certaine croissance pendant l’imagerie pendant une certaine période de temps, tout en limitant les mouvements de l’embryon. Certaines parties de l’embryon peuvent être efficacement représentées comme ceci. Cependant, lors de l’utilisation de cette méthode pour l’imagerie de l’embryon entier pendant de longues périodes de temps, des distorsions sont observées en raison de la croissance restreinte causée par l’agarose. Ainsi, d’autres méthodes de montage sont nécessaires. Kaufmann et ses collègues ont décrit un montage alternatif d’embryons de poisson zèbre pour la microscopie par feuille de lumière, comme la microscopie sélective d’éclairage d’avion (SPIM), en montant les embryons dans des tubes de propylène d’éthylène fluoré (FEP) contenant de faibles concentrations d’agarose ou de méthylcellulose2. Cette technique produit une superbe visualisation de l’embryogenèse au fil du temps. Schmid et coll. décrivent le montage de jusqu’à six embryons dans l’agarose dans les tubes FEB pour la microscopie de feuille de lumière3 fournissant la visualisation de plusieurs embryons dans une session d’imagerie. Les moules ont été utilisées pour créer des tableaux d’embryons pour le montage efficace d’un plus grand nombre d’embryons4. Masselkink et coll. ont construit des moules en plastique imprimés en 3D qui peuvent être utilisés pour fabriquer des moulages de silicium dans lequel les embryons de poissons zèbres à différents stades peuvent être placés, permettant le montage dans une position constante pour l’imagerie, y compris l’imagerie confocale5. L’impression 3D a également été utilisée pour fabriquer des moules pour un positionnement cohérent des embryons de poissons zèbres dans le format6de 96 puits. Certains moules sont personnalisés pour certaines étapes et peuvent ne pas permettre une croissance illimitée pendant de longues périodes, tandis que d’autres moules sont plus flexibles. Récemment, Weijts et coll. ont publié la conception et la fabrication d’un plat à quatre puits pour l’imagerie en direct des embryons de poissons zèbres7. Dans ce plat, la queue et le tronc des embryons de poissons anesthésiés sont placés manuellement sous un toit en silicone transparent fixé juste au-dessus d’un verre de couverture pour former une poche. L’embryon est alors fixé dans cette position par l’ajout de 0,4% agarose. Ce montage permet l’imagerie de la partie postérieure d’environ 2 mm de long (tronc et queue) de l’embryon, et comme jusqu’à 12 embryons peuvent être montés par puits, la méthode permet l’imagerie de plusieurs échantillons. De même, Hirsinger et Steventon ont récemment présenté une méthode où la tête du poisson est montée en agarose, tandis que la queue peut se développer librement, et cette méthode facilite également efficacement l’imagerie de la région du tronc et de la queue de l’embryon8.
Cet article décrit une méthode de montage en couches pour les embryons de poisson zèbre qui restreignent les mouvements des embryons tout en permettant une croissance illimitée. Les avantages de cette méthode de montage sont qu’il s’agit d’une méthode peu coûteuse, rapide et facile pour monter des embryons de différentes étapes pour l’imagerie à l’aide de n’importe quel microscope inversé. Le montage permet l’imagerie à long terme de l’ensemble du corps (tête, tronc et queue) pendant le développement de l’embryon. Pour mettre en valeur la convivialité de cette méthode, le développement vasculaire, neuronal et musculaire de l’embryon entier a été représenté chez des poissons transgéniques. Deux embryons par session, à deux longueurs d’onde en 3D ont été photographiés par microscopie en time-lapse pendant 55 heures consécutives pour rendre des films de développement de tissu.
Protocol
Representative Results
Discussion
Une méthode de montage pour la microscopie confocale de time-lapse prolongée des embryons entiers de poisson zèbre est décrite ici. L’étape la plus critique pour la méthode de montage est d’identifier la concentration optimale d’agarose qui permettra une croissance sans restriction des embryons de poisson zèbre, et en même temps de garder les embryons dans une position complètement fixe pour l’imagerie confocale. Parce que la concentration optimale d’agarose est très étroite, cette valeur est très sensible au…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Albert Pan et Arndt Sieakmann pour les dons de poissons transgéniques. Nous remercions Koichi Kawakami à l’Institut national de génétique, le projet national bioresource du ministère de l’Éducation, de la Culture, des Sports, des Sciences et de la Technologie du Japon pour le don du poisson zèbre transgénique HGn39b. Nous remercions également Fatima Merchant et Kathleen Gajewski pour leur aide en microscopie confocale, et Tracey Thériault pour ses photographies.
Ce travail a été soutenu par des subventions de l’Institut national des sciences de la santé environnementale des National Institutes of Health (numéro de subvention P30ES023512 et numéro de contrat HHSN27320150010C). SU a reçu l’appui d’une bourse du programme de biologie du cancer computationnelle Keck (Gulf Coast Consortia CPRIT grant RP140113) et du Hugh Roy and Lillie Endowment Fund. La Fondation Robert A. Welch (E-0004) a soutenu la Fondation Robert A. Welch.
Materials
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| Micro cover glass 22×22 mm | VWR | 48366 067 | |
| Leica DMi8 fluorescence microscope | Leica | NA | |
| LAS X software | Leica | NA | Microscope software |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Nikon A1S confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | NA | |
| Nikon NIS AR Version 4.40 | Nikon Instruments Inc. | NA | Microscope software |
References
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