طريقه تركيب طبقات لتمديد المجهر البؤري المجهري لأجنه الزبرافيش الكاملة بفواصل زمنيه طويلة
Summary
توضح هذه المقالة طريقه لتحميل الاجنه الضعيفة الهشة للحصول علي المجهر البؤري المطول الفاصل الزمني. هذه الطريقة منخفضه التكلفة سهله الأداء باستخدام الاطباق المجهرية العادية بالزجاج السفلي للتصوير علي اي مجهر مقلوب. يتم تنفيذ التركيب في طبقات من اجنشا في تركيزات مختلفه.
Abstract
ويمكن ان يعقب ديناميات التنمية المجهر الزمني الفاصل بين الاجنه الحية المحورة وراثيا التي تعبر عن الفلورية في انسجه أو خلايا محدده. صعوبة في التصوير تطوير الجنين كله هو ان الاجنه الزرد تنمو بشكل كبير في الطول. عندما شنت علي النحو الذي تم بانتظام في 0.3-1 ٪ ذوبان منخفضه نشات ، والاجنه يفرض قيود النمو ، مما يؤدي إلى تشوات في جسم الجنين لينه. ومع ذلك ، للقيام بالمجهر الزمني الفاصل ، يجب ان يتم شل الجنين. توضح هذه المقالة طريقه تركيب طبقات لأجنه الزيبرافيش التي تقيد حركيه الاجنه مع السماح بالنمو غير المقيد. يتم تنفيذ التركيب في طبقات من اجنشا في تركيزات مختلفه. لإثبات قابليه استخدام هذه الطريقة ، كان الجنين كله الاوعيه الدموية ، والخلايا العصبية وتنميه العضلات في الأسماك المحورة وراثيا لمده 55 ساعات متتالية. ويمكن استخدام هذه الطريقة المتصاعدة للتصوير سهله ومنخفضه التكلفة من الاجنه الزرد كله باستخدام المجاهر المقلوبة دون متطلبات قوالب أو المعدات الخاصة.
Introduction
ومنذ فتره طويلة كان الزبرافيش كائنا نموذجيا لعلم الاحياء التنموي ، والمجهر هو الطريقة الرئيسية لتصور التطور الجنيني. وتشمل مزايا استخدام الاجنه الزبرافيش للدراسات التنموية صغر الحجم ، والوضوح البصري ، والتطور السريع ، والخصوبة العالية للأسماك البالغة. وقد سمح الجيل من خطوط الزرد المحورة وراثيا التعبير عن الفلوري في بعض الانسجه أو الخلايا لتصور مباشر لتطوير الانسجه بطرق غير ممكنة مع أكبر الفقاري الحيوانية. الاقتران مع المجهر الزمني ، يمكن دراسة تفاصيل وديناميكيات تطور الانسجه بسهوله.
صعوبة مع التصوير التنمية الزرد هو ان الاجنه تنمو بشكل كبير في الطول; يمدد الجنين طوله أربعه أوقات ضمن الاولي 3 أيام الحياة1. كما ان جسم الجنين المبكر لين ، ويصبح مشوها بسهوله إذا كان النمو مقيدا. ومع ذلك ، للقيام بالمجهر البؤري ، يجب ان يتم شل الجنين. للحفاظ علي الاجنه في وضع ثابت للتصوير الفاصل الزمني البؤري ، يتم تخديرها بانتظام وتركيبها في 0.3-1 ٪ منخفضه الذوبان التي نشات. هذا له ميزه السماح لبعض النمو اثناء التصوير لفتره معينه من الزمن ، في حين تقييد تحركات الجنين. يمكن ان تكون أجزاء من الجنين فعاله مثل هذا. ومع ذلك ، عند استخدام هذه الطريقة لتصوير الجنين بأكمله لفترات زمنيه طويلة ، لوحظت تشوات بسبب النمو المحدود الناجم عن الاجنه. التالي ، هناك حاجه إلى أساليب التركيب الأخرى. وقد وصف كوفمان وزملاءه بديلا لتركيب الاجنه الخفيفة للحصول علي المجهر المجهري للضوء ، مثل المجهر الضوئي الانتقائي للطائرة (SPIM) ، عن طريق تركيب الاجنه في أنابيب الاثيلين البروبيلين (إثراء) المشبعة بالفلور التي تحتوي علي تركيزات منخفضه من الاغثار أو ميثيل سيلولوز2. وتنتج هذه التقنية تصورا رائعا لتولد الاجنه علي مر الزمن. ويصف شميد وآخرون تركيب ما يصل إلى سته أجنه في الأنابيب المجهرية للضوء بالورقة الخفيفة3 التي تقدم تصورا لعده أجنه في جلسة تصوير واحده. وقد استخدمت قوالب لإنشاء صفائف الاجنه لتركيب فعال لاعداد أكبر من الاجنه4. وقد شيدت masselkink وآخرون قوالب البلاستيك المطبوعة 3d التي يمكن استخدامها لجعل يلقي السيليكون ان الاجنه الزرد في مراحل مختلفه يمكن وضعها في ، وتمكين تصاعد في موقف ثابت للتصوير ، بما في ذلك التصوير البؤري5. وقد استخدمت الطباعة 3d أيضا لجعل قوالب لتحديد المواقع متسقة من الاجنه الزرد في شكل 96-بئر6. يتم تخصيص بعض القوالب لمراحل معينه ، وقد لا تسمح النمو غير المقيد لفترات زمنيه طويلة ، في حين ان قوالب أخرى أكثر مرونة. وفي الاونه الاخيره ، نشرت Weijts et al. تصميم وتصنيع طبق من أربعه ابار للتصوير الحي لأجنه الزيبرافيش7. في هذا الطبق ، يتم وضع ذيل وجذع الاجنه السمكية التخدير يدويا تحت سقف السيليكون واضحة المرفقة فقط فوق الزجاج غطاء لتشكيل جيب. ثبتت الجنين بعد ذلك في هذا موقعه بالاضافه من 0.4% [اغبرز]. هذا التصاعد يسمح للتصوير حوالي 2 مم الجزء الخلفي طويلة (الجذع والذيل) من الجنين ، وبما يصل إلى 12 الاجنه يمكن تركيبها في بئر ، وطريقه يسمح للتصوير من عينات متعددة. المثل ، قدم Hirsinger و Steventon مؤخرا طريقه حيث يتم تركيب راس السمكة في اجنشا ، في حين ان الذيل يمكن ان تنمو بحريه ، وهذا الأسلوب أيضا يسهل بكفاءة التصوير من الجذع ومنطقه الذيل من الجنين8.
توضح هذه المقالة طريقه متصاعدة من الطبقات لأجنه الزيبرافيش التي تقيد حركات الاجنه مع السماح بالنمو غير المقيد. مزايا هذه الطريقة المتصاعدة هي انها طريقه منخفضه التكلفة وسريعة وسهله لتحميل الاجنه من مختلف المراحل للتصوير باستخدام اي المجهر المقلوب. التركيب يسمح التصوير علي المدى الطويل من الجسم كله (الراس والجذع والذيل) اثناء تطوير الجنين. لعرض قابليه استخدام هذه الطريقة ، كان الجنين كله الاوعيه الدموية ، والخلايا العصبية وتنميه العضلات في الأسماك المحورة وراثيا. وقد أصيب اثنان من الاجنه في الدورة الواحدة ، في فترتين موجيتين ثلاثيتي الابعاد ، بالمجهر الزمني لمده 55 ساعة متتالية لتقديم أفلام عن تطور الانسجه.
Protocol
Representative Results
Discussion
ويرد هنا طريقه متصاعدة لتمديد المجهر البؤري المجهري لأجنه الزبرافيش الكاملة. الخطوة الأكثر اهميه بالنسبة لطريقه التركيب هي تحديد التركيز الأمثل للنشا الذي سيسمح بنمو الجنين الزبرفيش غير المقيد ، وفي الوقت نفسه إبقاء الاجنه في وضع ثابت تماما للتصوير البؤري. ونظرا لان التركيز الأمثل للاغ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر البرت بان و أردت Sieakmann علي هدايا الأسماك المحورة وراثيا. نشكر كويشي كاواكامي في المعهد الوطني لعلم الوراثة ، المشروع الوطني للموارد البيولوجية التابع لوزارة التعليم والثقافة والرياضة والعلوم والتكنولوجيا في اليابان علي هديه الHGn39bالمحورة وراثيا. ونشكر أيضا فاطمة ميرشانت وكاثلين غايجوسكي علي المساعدة في المجهر البؤري ، وعلي تريسي ثيرتيولت للصور الفوتوغرافية.
وقد دعم هذا العمل بمنح من المعهد الوطني لعلوم الصحة البيئية التابع للمعاهد الوطنية للصحة (المنحة رقم P30ES023512 ورقم العقد HHSN273201500010C). وقد دعمت الرابطة زمالة من برنامج البيولوجيا الحاسوبية للسرطان (Keck) (اتحاد ساحل الخليج كبريت منحه RP140113) ومن قبل صندوق هبات هيو روي وليلي. وقد دعمت مؤسسه روبرت ا. ويلش (0004).
Materials
| Low melting agarose | Sigma-Aldrich, MO | A9414 | Store dissolved solution at 4 °C |
| 35 mm glass bottom dishes with No. 0 coverslip and 10 mm diameter of glass bottom | MatTek Corporation, MA | P35GCOL-0-10-C | |
| Tricaine (MS-222) | Sigma-Aldrich, MO | E10521 | Store dissolved solution at 4 °C |
| N-phenylthiourea (PTU) | Sigma-Aldrich, MO | P7629 | Store dissolved solution at -20 °C |
| Micro cover glass 22×22 mm | VWR | 48366 067 | |
| Leica DMi8 fluorescence microscope | Leica | NA | |
| LAS X software | Leica | NA | Microscope software |
| DMC4500 digital microscope camera | Leica | NA | |
| Nikon A1S confocal microscope | Nikon Instruments Inc. | NA | |
| Nikon NIS AR Version 4.40 | Nikon Instruments Inc. | NA | Microscope software |
References
- Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. Stages of embryonic development of the zebrafish. Developmental Dynamics. 203 (3), 253-310 (1995).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nature Communications. 4, 2207 (2013).
- Megason, S. G. In toto imaging of embryogenesis with confocal time-lapse microscopy. Methods in Molecular Biology. 546, 317-332 (2009).
- Masselink, W., Wong, J. C., Liu, B., Fu, J., Currie, P. D. Low-cost silicone imaging casts for zebrafish embryos and larvae. Zebrafish. 11 (1), 26-31 (2014).
- Wittbrodt, J. N., Liebel, U., Gehrig, J. Generation of orientation tools for automated zebrafish screening assays using desktop 3D printing. BMC Biotechnology. 14, 36 (2014).
- Weijts, B., Tkachenko, E., Traver, D., Groisman, A. A Four-Well Dish for High-Resolution Longitudinal Imaging of the Tail and Posterior Trunk of Larval Zebrafish. Zebrafish. 14 (5), 489-491 (2017).
- Hirsinger, E., Steventon, B. A Versatile Mounting Method for Long Term Imaging of Zebrafish Development. Journal of Visualized Experiment. (119), (2017).
- Avdesh, A., et al. Regular care and maintenance of a zebrafish (Danio rerio) laboratory: an introduction. Journal of Visualized Experiment. (69), e4196 (2012).
- McCollum, C. W., et al. Embryonic exposure to sodium arsenite perturbs vascular development in zebrafish. Aquatic Toxicology. 152, 152-163 (2014).
- Pan, Y. A., et al. Zebrabow: multispectral cell labeling for cell tracing and lineage analysis in zebrafish. Development. 140 (13), 2835-2846 (2013).
- Asakawa, K., et al. Genetic dissection of neural circuits by Tol2 transposon-mediated Gal4 gene and enhancer trapping in zebrafish. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 105 (4), 1255-1260 (2008).
- Nagayoshi, S., et al. Insertional mutagenesis by the Tol2 transposon-mediated enhancer trap approach generated mutations in two developmental genes: tcf7 and synembryn-like. Development. 135 (1), 159-169 (2008).
- Huang, W. C., et al. Combined use of MS-222 (tricaine) and isoflurane extends anesthesia time and minimizes cardiac rhythm side effects in adult zebrafish. Zebrafish. 7 (3), 297-304 (2010).
- Craig, M. P., Gilday, S. D., Hove, J. R. Dose-dependent effects of chemical immobilization on the heart rate of embryonic zebrafish. Laboratory Animal (NY). 35 (9), 41-47 (2006).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), 0134005 (2015).
