Fare İskelet Kas Ekstranında Primer Miyoblastların İzolasyon ve Farklılaşması
Summary
Miyoblastlar polinükleatlı miyotüpler ve sonunda iskelet kası miyofiberleri oluşturmak için farklılaşan öncül hücrelerdir. Burada, genç yetişkin fare iskelet kaslarından etkili izolasyon ve birincil miyoblast kültürü için bir protokol salıyoruz. Bu yöntem, kültürdeki kas hücrelerinin moleküler, genetik ve metabolik çalışmalarını mümkün kılar.
Abstract
Primer miyoblastlar iskelet kasının farklılaşmamış çoğalan öncüleridir. Onlar kültürlü ve kas öncüleri olarak çalışılmış veya kas gelişiminin daha sonraki aşamalarında ayırt etmek için indüklenen. Burada sağlanan protokol, genç yetişkin fare iskelet kas ekstrandan mıyoblast hücrelerinin son derece çoğalan popülasyonunun izolasyonu ve kültürü için sağlam bir yöntem tanımlanmaktadır. Bu hücreler farklı fare modellerinin iskelet kasının metabolik özelliklerinin yanı sıra eksojen DNA ile transfeksiyon veya viral ekspresyon vektörleri ile transdüksiyon gibi diğer downstream uygulamalarında da yararlıdır. Bu hücrelerin farklılaşma ve metabolik profil düzeyi maruz kalma uzunluğuna ve miyoblast farklılaşmasını sağlamak için kullanılan ortamın bileşimine bağlıdır. Bu yöntemler fare kas hücre metabolizması ex vivo çalışması için sağlam bir sistem sağlar. Daha da önemlisi, in vivo modellerinaksine, burada açıklanan yöntemler genişletilebilir ve tekrarlanabilirlik yüksek düzeyde çalışılabilir bir hücre popülasyonu sağlar.
Introduction
Genellikle genel metabolik sağlığın bir göstergesi olarak atıfta bulunulsa da, birden fazla çalışma, yaşlı erişkinlerde vücut kitle indeksi (VKİ) sürekli mortalite yüksek risk ile ilişkili olmadığını göstermiştir. Bugüne kadar, bu popülasyonda azaltılmış mortalite ile tutarlı olduğu gösterilen tek faktör kaskütlesi1 artmıştır. Kas dokusu vücuttaki insülin duyarlı hücrelerin en büyük kaynaklarından birini temsil eder, ve bu nedenle genel metabolik homeostazbakımındakritik 2 . Egzersiz yoluyla iskelet kas dokusunun aktivasyonu hem lokal insülin duyarlılığı hem de genel metabolik sağlık artışlar ile ilişkilidir3. In vivo modelleri kas fizyolojisi ve entegre metabolizma üzerinde kas fonksiyonunun etkisi eğitimi için gerekli iken, miyotüplerin birincil kültürleri hayvan çalışmalarının karmaşıklığını azaltan bir sistem sağlar.
Doğum sonrası kaslardan elde edilen miyoblastlar, çok sayıda tedavi ve büyüme koşullarının etkisini son derece tekrarlanabilir bir şekilde incelemek için kullanılabilir. Bu uzun ve myoblast izolasyon ve kültür için çeşitli yöntemler4,5,6,7,8,9tarif edilmiştir kabul edilmiştir. Bu yöntemlerden bazıları yenidoğan kasları kullanmak ve miyoblastlar nispeten düşük sayıda verim5,8, büyük ölçekli çalışmalar için çeşitli hayvanlar gerektiren. Ayrıca, miyoblastların kültüre getirilmesinde en yaygın kullanılan yöntemler, diğer hücre türlerine göre daha az yapışık olan miyoblastlar için zenginleştirmek için “ön kaplama” yöntemini kullanır. Burada açıklanan alternatif zenginleştirme yönteminin, son derece çoğalan miyoblast popülasyonunu zenginleştirmek için çok daha verimli ve tekrarlanabilir olduğunu gördük. Özetle, bu protokol, genç erişkin kas eksperlerinden son derece çoğalan miyoblastların kültür ortamına büyüme yoluyla izolasyonuna olanak sağlamaktadır. Miyoblastlar tekrar tekrar hasat edilebilir, birkaç gün içinde, hızla genişletilmiş, ve miyotüpler içine ayırt etmek için indüklenen. Bu protokol, spontan seğirme miyotüpleri sevese doğru sağlam bir şekilde ayıran çok sayıda sağlıklı miyoblast hücresi üretir. Çeşitli genotiplere sahip farelerin primer miyotubelarında metabolizma ve sirkadiyen ritimleri incelememizi sağladı. Son olarak, 96 kuyulu plakalarda oksijen tüketim oranlarının ölçümlerini kullanarak miyotüplerin oksidatif metabolizma çalışmaları için hazırlanmasına yönelik yöntemleri de sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
İskelet kası metabolik homeostazın kurulması ve bakımı için hayati önem taşımaktadır11. Kas fizyolojisi çalışması, bireyler arası değişkenlik ve özellikle insan çalışmaları söz konusu olduğunda örnek almada güçlük nedeniyle karmaşıktır. Kültürlü primer miyotüpler kas fizyolojisi birçok özelliği recapitulate gösterilmiştir, kalsiyum homeostaz dahil12, hasarlı kas dokusunun rejenerasyon5, egzersiz yanıt metabo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar Melbourne Üniversitesi’nden Dr Matthew Watt ve Johns Hopkins Üniversitesi’nden Dr Anastasia Kralli yardım mokbel veark. 6çalışmalarına dayalı bu protokolü benimseyen için minnettarız. Ayrıca Dr. Sabine Jordan’a bu protokolün laboratuarımızda geliştirilmesi ve benimsenmesi için teşekkür ederiz. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri R01s DK097164 ve DK112927 tarafından K.A.L. tarafından finanse edilmiştir.
Materials
| Coating Solution: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Collagen | Life Technologies | A1064401 | 1.7 mL |
| Matrigel | Fisher | CB40234A | 1 mL |
| Plating Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Myoblast Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Differentiation Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Heat Inactivated Horse Serum | Sigma | H1138 | 1.5 mL |
| Insulin-Selenium-Transferrin | Life Technologies | 41400045 | 0.5 mL |
| Other Materials: | |||
| PBS | Gibco | 14040133 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells |
| Forceps | Any | ||
| Razor Blades | Any | ||
| Scissors | Any | ||
| Whatman paper | VWR | 21427-648 | |
| 60 mm plate | VWR | 734-2318 | |
| 10 cm plate | VWR | 25382-428 (CS) | |
| T25 Flasks | ThermoFisher | 156367 | |
| T75 Flasks | ThermoFisher | 156499 | |
| Centrifuge Tubes (15mL) | BioPioneer | CNT-15 | |
| Oxygen Consumption Rates: | |||
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Seahorse XFe96 Analyzer | Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | 96-well plates for use in XFe96 Analyzer |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate | Agilent | 102720-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Palmitic acid | Sigma | P5585-10G | for measurement of fatty acid oxidation |
| carnitine | Sigma | C0283-5G | for measurement of fatty acid oxidation |
| Etomoxir | Sigma | E1905 | for measurement of fatty acid oxidation |
| BSA | Sigma | A7030 | used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation |
References
- Srikanthan, P., Karlamangla, A. S. Muscle mass index as a predictor of longevity in older adults. American Journal of Medicine. 127 (6), 547-553 (2014).
- Lee-Young, R. S., Kang, L., Ayala, J. E., Wasserman, D. H., Fueger, P. T. The physiological regulation of glucose flux into muscle in vivo. Journal of Experimental Biology. 214 (2), 254-262 (2010).
- Sjøberg, K. A., et al. Exercise increases human skeletal muscle insulin sensitivity via coordinated increases in microvascular perfusion and molecular signaling. Diabetes. 66 (6), 1501-1510 (2017).
- Girgis, C. M., Clifton-Bligh, R. J., Mokbel, N., Cheng, K., Gunton, J. E. Vitamin D signaling regulates proliferation, differentiation, and myotube size in C2C12 skeletal muscle cells. Endocrinology. 155 (2), 347-357 (2014).
- Smith, J., Merrick, D. Embryonic skeletal muscle microexplant culture and isolation of skeletal muscle stem cells. Methods in Molecular Biology. 633, 29-56 (2010).
- Mokbel, N., et al. K7del is a common TPM2 gene mutation associated with nemaline myopathy and raised myofibre calcium sensitivity. Brain. 136 (2), 494-507 (2013).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. Journal of Cell Biology. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Musarò, A., Carosio, S. Isolation and Culture of Satellite Cells from Mouse Skeletal Muscle. Methods in Molecular Biology. 1553, 155-167 (2017).
- Smolina, N., Bruton, J., Kostareva, A., Sejersen, T. Assaying mitochondrial respiration as an indicator of cellular metabolism and fitness. Methods in Molecular Biology. 1601, 79-87 (2017).
- Elliott, B., Renshaw, D., Getting, S., Mackenzie, R. The central role of myostatin in skeletal muscle and whole body homeostasis. Acta Physiologica. 205 (3), 324-340 (2012).
- Smolina, N., Kostareva, A., Bruton, J., Karpushev, A., Sjoberg, G., Sejersen, T. Primary murine myotubes as a model for investigating muscular dystrophy. BioMed Research International. , (2015).
- Nedachi, T., Fujita, H., Kanzaki, M. Contractile C 2 C 12 myotube model for studying exercise-inducible responses in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 295 (5), E1191-E1204 (2008).
- Chen, M. B., et al. Impaired activation of AMP-kinase and fatty acid oxidation by globular adiponectin in cultured human skeletal muscle of obese type 2 diabetics. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (6), 3665-3672 (2005).
- Douillard-Guilloux, G., Mouly, V., Caillaud, C., Richard, E. Immortalization of murine muscle cells from lysosomal α-glucosidase deficient mice: A new tool to study pathophysiology and assess therapeutic strategies for Pompe disease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 388 (2), 333-338 (2009).
- Varga, B., et al. Myotube elasticity of an amyotrophic lateral sclerosis mouse model. Scientific Reports. 8 (1), 5917 (2018).
- Kriebs, A., et al. Circadian repressors CRY1 and CRY2 broadly interact with nuclear receptors and modulate transcriptional activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 8776-8781 (2017).
- Cho, Y., et al. Perm1 enhances mitochondrial biogenesis, oxidative capacity, and fatigue resistance in adult skeletal muscle. FASEB Journal. 30 (2), 674-687 (2016).
