Aislamiento y diferenciación de los mioblastos primarios de los explantes musculares esqueléticos de ratón
Summary
Los mióblastos están proliferando en células precursoras que se diferencian para formar miotubos polinucleados y, finalmente, miofibers musculares esqueléticos. Aquí, presentamos un protocolo para el aislamiento eficiente y el cultivo de mioblastos primarios de los músculos esqueléticos adultos jóvenes. El método permite estudios moleculares, genéticos y metabólicos de las células musculares en el cultivo.
Abstract
Los mioblastos primarios son precursores proliferantes indiferenciados del músculo esquelético. Pueden ser cultivados y estudiados como precursores musculares o inducidos para diferenciarse en etapas posteriores del desarrollo muscular. El protocolo proporcionado aquí describe un método robusto para el aislamiento y el cultivo de una población altamente proliferativa de células mioblastecas de explantes musculares esqueléticos de ratón adulto joven. Estas células son útiles para el estudio de las propiedades metabólicas del músculo esquelético de diferentes modelos de ratón, así como en otras aplicaciones aguas abajo como la transfección con ADN exógeno o la transducción con vectores de expresión viral. El nivel de diferenciación y perfil metabólico de estas células depende de la duración de la exposición y de la composición de los medios utilizados para inducir la diferenciación de mioblastos. Estos métodos proporcionan un sistema robusto para el estudio del metabolismo de las células musculares de la ratón ex vivo. Es importante destacar que, a diferencia de los modelos in vivo, los métodos descritos aquí proporcionan una población celular que se puede ampliar y estudiar con altos niveles de reproducibilidad.
Introduction
Aunque a menudo se cita como una indicación de la salud metabólica general, múltiples estudios han demostrado que el índice de masa corporal (IMC) en adultos mayores no se asocia consistentemente con un mayor riesgo de mortalidad. Hasta la fecha, el único factor que ha demostrado ser consistente con la reducción de la mortalidad en esta población es el aumento de la masa muscular1. El tejido muscular representa una de las mayores fuentes de células sensibles a la insulina en el cuerpo, y por lo tanto es crítico en el mantenimiento de la homeostasis metabólica general2. La activación del tejido muscular esquelético a través del ejercicio se asocia con aumentos tanto en la sensibilidad local a la insulina como en la salud metabólica general3. Mientras que los modelos in vivo son esenciales para estudiar la fisiología muscular y el impacto de la función muscular en el metabolismo integrado, los cultivos primarios de miotubos proporcionan un sistema manejable que reduce la complejidad de los estudios en animales.
Los mióblastos derivados de los músculos postnatales se pueden utilizar para estudiar el impacto de numerosas condiciones de tratamiento y crecimiento de una manera altamente reproducible. Esto ha sido reconocido durante mucho tiempo y se han descrito varios métodos para el aislamiento y el cultivo de mioblastos4,5,6,7,8,9. Algunos de estos métodos utilizan músculos neonatales y producen un número relativamente bajo de mioblastos5,8,que requieren varios animales para estudios a mayor escala. Además, los métodos más utilizados para el cultivo de mioblastos utilizan “pre-plating” para enriquecer los mioblastos, que son menos adherentes que otros tipos de células. Hemos encontrado que el método de enriquecimiento alternativo descrito aquí es mucho más eficiente y reproducible para enriquecer una población de mioblastos altamente proliferativos. En resumen, este protocolo permite el aislamiento de mioblastos altamente proliferativos de explantes musculares adultos jóvenes, a través del crecimiento en los medios de cultivo. Los mióblastos se pueden cosechar repetidamente, durante varios días, expandirse rápidamente e inducirse a diferenciarse en miotubos. Este protocolo genera reproduciblemente un gran número de células de mioblasto sano que se diferencian sólidamente en miotubos de espasmos espontáneamente. Nos ha permitido estudiar el metabolismo y los ritmos circadianos en miotubos primarios de ratones de una variedad de genotipos. Por último, incluimos métodos para preparar miotubos para el estudio del metabolismo oxidativo, utilizando mediciones de las tasas de consumo de oxígeno en placas de 96 pocillos.
Protocol
Representative Results
Discussion
El músculo esquelético es vital para el establecimiento y mantenimiento de la homeostasis metabólica11. El estudio de la fisiología muscular se complica por la variabilidad interindividual, así como la dificultad para obtener muestras, especialmente en el caso de estudios en humanos. Se ha demostrado que los miotubos primarios cultivados recapitulan muchas características de la fisiología muscular, incluyendo la homeostasis de calcio12,la regeneración del tejido mus…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores están agradecidos al Dr. Matthew Watt en la Universidad de Melbourne y a la Dra. Anastasia Kralli de la Universidad Johns Hopkins por la asistencia para adoptar este protocolo basado en el trabajo de Mokbel et al.6. También damos las gracias a la Dra. Sabine Jordan por su asistencia en el desarrollo y adopción de este protocolo en nuestro laboratorio. Este trabajo fue financiado por los Institutos Nacionales de Salud R01s DK097164 y DK112927 a K.A.L.
Materials
| Coating Solution: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Collagen | Life Technologies | A1064401 | 1.7 mL |
| Matrigel | Fisher | CB40234A | 1 mL |
| Plating Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Myoblast Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Differentiation Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Heat Inactivated Horse Serum | Sigma | H1138 | 1.5 mL |
| Insulin-Selenium-Transferrin | Life Technologies | 41400045 | 0.5 mL |
| Other Materials: | |||
| PBS | Gibco | 14040133 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells |
| Forceps | Any | ||
| Razor Blades | Any | ||
| Scissors | Any | ||
| Whatman paper | VWR | 21427-648 | |
| 60 mm plate | VWR | 734-2318 | |
| 10 cm plate | VWR | 25382-428 (CS) | |
| T25 Flasks | ThermoFisher | 156367 | |
| T75 Flasks | ThermoFisher | 156499 | |
| Centrifuge Tubes (15mL) | BioPioneer | CNT-15 | |
| Oxygen Consumption Rates: | |||
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Seahorse XFe96 Analyzer | Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | 96-well plates for use in XFe96 Analyzer |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate | Agilent | 102720-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Palmitic acid | Sigma | P5585-10G | for measurement of fatty acid oxidation |
| carnitine | Sigma | C0283-5G | for measurement of fatty acid oxidation |
| Etomoxir | Sigma | E1905 | for measurement of fatty acid oxidation |
| BSA | Sigma | A7030 | used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation |
References
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