Изоляция и дифференциация первичных миобластов от мышь скелетных мышц высасывания
Summary
Myoblasts являются размножающимися клетками-предшественниками, которые дифференцируются, образуя полинуклиатые миотубины и в конечном итоге скелетные мышцы миофиберов. Здесь мы представляем протокол для эффективной изоляции и культуры первичных миобластов от молодых взрослых мышечных скелетных мышц. Метод позволяет молекулярные, генетические и метаболические исследования мышечных клеток в культуре.
Abstract
Первичные миобласты являются недифференцированными пролиферирующими предшественниками скелетных мышц. Они могут быть культивированы и изучены в качестве предшественников мышц или индуцированных дифференцировать в более поздних стадиях развития мышц. Протокол, представленный здесь, описывает надежный метод изоляции и культуры высокопролиферативной популяции клеток миобласта от молодых взрослых вылабов мышц скелета мыши. Эти клетки полезны для изучения метаболических свойств скелетных мышц различных моделей мыши, а также в других приложениях вниз по течению, таких как трансфекция с экзогенной ДНК или трансдукция с вектором вирусного выражения. Уровень дифференциации и метаболического профиля этих клеток зависит от продолжительности воздействия, и состав средств массовой информации, используемых для индуцирования дифференциации миобластов. Эти методы обеспечивают надежную систему для изучения метаболизма мышечных клеток мыши ex vivo. Важно отметить, что, в отличие от моделей in vivo, описанные здесь методы обеспечивают популяцию клеток, которые могут быть расширены и изучены с высоким уровнем воспроизводимости.
Introduction
Хотя часто цитируется в качестве признака общего метаболического здоровья, несколько исследований показали, что индекс массы тела (ИМТ) у пожилых людей не всегда связано с более высоким риском смертности. На сегодняшний день единственным фактором, который, как было показано, соответствует снижению смертности в этой популяции, является увеличение мышечной массы1. Мышечная ткань представляет собой один из крупнейших источников чувствительных к инсулину клеток в организме, и поэтому имеет решающее значение в поддержании общего метаболического гомеостаза2. Активация скелетной мышечной ткани с помощью физических упражнений связана с повышением чувствительности к местному инсулину и общего метаболического здоровья3. В то время как модели in vivo необходимы для изучения физиологии мышц и влияния мышечной функции на интегрированный метаболизм, первичные культуры миотубеб обеспечивают убираемую систему, которая снижает сложность исследований на животных.
Миобласты, полученные из послеродовых мышц, могут быть использованы для изучения влияния многочисленных условий лечения и роста в высоко воспроизводимым образом. Это уже давно признано и несколько методов для изоляции миобласти и культуры были описаны4,5,6,7,8,9. Некоторые из этих методов используют неонатальные мышцы и дают относительно небольшое количество миобластов5,8, требующих нескольких животных для более масштабных исследований. Кроме того, наиболее широко используемые методы культивирования миобластов используют «предварительное покрытие» для обогащения миобластов, которые менее привержены, чем другие типы клеток. Мы обнаружили, что альтернативный метод обогащения, описанный здесь, является гораздо более эффективным и воспроизводимым для обогащения высокопролиферативной популяции мизобластов. Таким образом, этот протокол позволяет изоляции высоко пролиферативных миобластов от молодых взрослых мышц explants, через нарост в культуре средств массовой информации. Myoblasts можно собрать повторно, над несколькими днями, быстро расширено, и наведено для того чтобы продифференцировать в myotubes. Этот протокол воспроизводит большое количество здоровых клеток миобласта, которые надежно дифференцируются в спонтанно подергивания миотубебий. Это позволило нам изучать метаболизм и циркадные ритмы в первичных миотубеусах мышей различных генотипов. Наконец, мы включаем методы подготовки миотубев для изучения окислительного метаболизма, используя измерения уровня потребления кислорода в 96-колодцах.
Protocol
Representative Results
Discussion
Скелетные мышцы имеют жизненно важное значение для создания и поддержания метаболического гомеостаза11. Изучение физиологии мышц осложняется межиндивидуальной изменчивостью, а также трудностями в получении образцов, особенно в случае человеческих исследований. Культур?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарны д-ру Мэтью Уотту (Matthew Watt) из Мельбурнского университета и доктору Анастасии Кралли (Anastasia Kralli) из Университета Джонса Хопкинса за помощь в принятии этого протокола, основанного на работе Мокбеля и др.6. Мы также благодарим д-ра Сабину Джордан за помощь в разработке и принятии этого протокола в нашей лаборатории. Эта работа была профинансирована Национальными институтами здравоохранения R01s DK097164 и DK112927 в К.А.Л.
Materials
| Coating Solution: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Collagen | Life Technologies | A1064401 | 1.7 mL |
| Matrigel | Fisher | CB40234A | 1 mL |
| Plating Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Myoblast Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Differentiation Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Heat Inactivated Horse Serum | Sigma | H1138 | 1.5 mL |
| Insulin-Selenium-Transferrin | Life Technologies | 41400045 | 0.5 mL |
| Other Materials: | |||
| PBS | Gibco | 14040133 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells |
| Forceps | Any | ||
| Razor Blades | Any | ||
| Scissors | Any | ||
| Whatman paper | VWR | 21427-648 | |
| 60 mm plate | VWR | 734-2318 | |
| 10 cm plate | VWR | 25382-428 (CS) | |
| T25 Flasks | ThermoFisher | 156367 | |
| T75 Flasks | ThermoFisher | 156499 | |
| Centrifuge Tubes (15mL) | BioPioneer | CNT-15 | |
| Oxygen Consumption Rates: | |||
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Seahorse XFe96 Analyzer | Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | 96-well plates for use in XFe96 Analyzer |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate | Agilent | 102720-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Palmitic acid | Sigma | P5585-10G | for measurement of fatty acid oxidation |
| carnitine | Sigma | C0283-5G | for measurement of fatty acid oxidation |
| Etomoxir | Sigma | E1905 | for measurement of fatty acid oxidation |
| BSA | Sigma | A7030 | used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation |
References
- Srikanthan, P., Karlamangla, A. S. Muscle mass index as a predictor of longevity in older adults. American Journal of Medicine. 127 (6), 547-553 (2014).
- Lee-Young, R. S., Kang, L., Ayala, J. E., Wasserman, D. H., Fueger, P. T. The physiological regulation of glucose flux into muscle in vivo. Journal of Experimental Biology. 214 (2), 254-262 (2010).
- Sjøberg, K. A., et al. Exercise increases human skeletal muscle insulin sensitivity via coordinated increases in microvascular perfusion and molecular signaling. Diabetes. 66 (6), 1501-1510 (2017).
- Girgis, C. M., Clifton-Bligh, R. J., Mokbel, N., Cheng, K., Gunton, J. E. Vitamin D signaling regulates proliferation, differentiation, and myotube size in C2C12 skeletal muscle cells. Endocrinology. 155 (2), 347-357 (2014).
- Smith, J., Merrick, D. Embryonic skeletal muscle microexplant culture and isolation of skeletal muscle stem cells. Methods in Molecular Biology. 633, 29-56 (2010).
- Mokbel, N., et al. K7del is a common TPM2 gene mutation associated with nemaline myopathy and raised myofibre calcium sensitivity. Brain. 136 (2), 494-507 (2013).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. Journal of Cell Biology. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Musarò, A., Carosio, S. Isolation and Culture of Satellite Cells from Mouse Skeletal Muscle. Methods in Molecular Biology. 1553, 155-167 (2017).
- Smolina, N., Bruton, J., Kostareva, A., Sejersen, T. Assaying mitochondrial respiration as an indicator of cellular metabolism and fitness. Methods in Molecular Biology. 1601, 79-87 (2017).
- Elliott, B., Renshaw, D., Getting, S., Mackenzie, R. The central role of myostatin in skeletal muscle and whole body homeostasis. Acta Physiologica. 205 (3), 324-340 (2012).
- Smolina, N., Kostareva, A., Bruton, J., Karpushev, A., Sjoberg, G., Sejersen, T. Primary murine myotubes as a model for investigating muscular dystrophy. BioMed Research International. , (2015).
- Nedachi, T., Fujita, H., Kanzaki, M. Contractile C 2 C 12 myotube model for studying exercise-inducible responses in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 295 (5), E1191-E1204 (2008).
- Chen, M. B., et al. Impaired activation of AMP-kinase and fatty acid oxidation by globular adiponectin in cultured human skeletal muscle of obese type 2 diabetics. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (6), 3665-3672 (2005).
- Douillard-Guilloux, G., Mouly, V., Caillaud, C., Richard, E. Immortalization of murine muscle cells from lysosomal α-glucosidase deficient mice: A new tool to study pathophysiology and assess therapeutic strategies for Pompe disease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 388 (2), 333-338 (2009).
- Varga, B., et al. Myotube elasticity of an amyotrophic lateral sclerosis mouse model. Scientific Reports. 8 (1), 5917 (2018).
- Kriebs, A., et al. Circadian repressors CRY1 and CRY2 broadly interact with nuclear receptors and modulate transcriptional activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 8776-8781 (2017).
- Cho, Y., et al. Perm1 enhances mitochondrial biogenesis, oxidative capacity, and fatigue resistance in adult skeletal muscle. FASEB Journal. 30 (2), 674-687 (2016).
