Isolatie en differentiatie van primaire Myoblasten van muis skeletspieren Explants
Summary
Myoblasten zijn prolifererende precursor cellen die differentiëren om polynucleated myotubes en uiteindelijk skeletspieren myofibers vormen. Hier presenteren we een protocol voor efficiënte isolatie en cultuur van primaire myoblasten van jonge volwassen muis skeletspieren. De methode maakt moleculaire, genetische, en metabole studies van spiercellen in de cultuur.
Abstract
Primaire myoblasten zijn niet-gedifferentieerde prolifererende precursoren van skeletspieren. Ze kunnen worden gekweekt en bestudeerd als spier precursoren of geïnduceerd om te differentiëren in latere stadia van spierontwikkeling. Het protocol dat hier wordt beschreven, beschrijft een robuuste methode voor de isolatie en cultuur van een zeer proliferatieve populatie van Myoblast cellen van jonge volwassen muis skeletspieren explanten. Deze cellen zijn nuttig voor de studie van de metabolische eigenschappen van de skeletspieren van verschillende muismodellen, evenals in andere downstream toepassingen zoals transfectie met exogene DNA of transductie met virale expressie vectoren. Het niveau van differentiatie en metabole Profiel van deze cellen is afhankelijk van de lengte van de blootstelling, en de samenstelling van de media die worden gebruikt voor het opwekken van Myoblast differentiatie. Deze methoden bieden een robuust systeem voor de studie van muis spiercellen metabolisme ex vivo. Belangrijk is dat, in tegenstelling tot in vivo-modellen, de hier beschreven methoden zorgen voor een celpopulatie die kan worden uitgebreid en bestudeerd met hoge reproduceerbaarheids niveaus.
Introduction
Hoewel vaak aangehaald als een indicatie van de algehele metabole gezondheid, meerdere studies hebben aangetoond dat body mass index (BMI) bij oudere volwassenen is niet consistent geassocieerd met een hoger risico van sterfte. Tot op heden is de enige factor die consistent is met verminderde sterfte in deze populatie toegenomen spier massa1. Spierweefsel vertegenwoordigt een van de grootste bronnen van insuline-gevoelige cellen in het lichaam, en is daarom kritisch in het onderhoud van de totale metabole homeostase2. Activering van skeletspier weefsel via oefening wordt geassocieerd met stijgingen van zowel de lokale insulinegevoeligheid en de algehele metabole gezondheid3. Terwijl in vivo modellen zijn essentieel voor het bestuderen van de spier fysiologie en de impact van de spierfunctie op geïntegreerde metabolisme, primaire culturen van myotubes bieden een Tractable systeem dat de complexiteit van dierproeven vermindert.
Myoblasten afgeleid van postnatale spieren kunnen worden gebruikt om de impact van talrijke behandelings-en groeicondities op een zeer reproduceerbare manier te bestuderen. Dit is al lang erkend en verschillende methoden voor Myoblast isolatie en cultuur zijn beschreven4,5,6,7,8,9. Sommige van deze methoden gebruiken neonatale spieren en leveren relatief lage aantallen myoblasten op,5,8, waarvoor meerdere dieren nodig zijn voor grootschalig onderzoek. Ook de meest gebruikte methoden voor het kweken van myoblasten gebruiken “pre-plating” om te verrijken voor myoblasten, die minder hecht zijn dan andere celtypen. We hebben geconstateerd dat de alternatieve verrijkings methode die hier wordt beschreven veel efficiënter en reproduceerbaar is voor het verrijken van een zeer proliferatieve Myoblast populatie. Samengevat, dit protocol maakt de isolatie van zeer proliferatieve myoblasten van jonge volwassen spier Explants, via uitgroei in cultuur media. Myoblasten kunnen herhaaldelijk worden geoogst, gedurende meerdere dagen, snel uitgebreid, en geïnduceerd om te differentiëren in myotubes. Dit protocol reproduceerd genereert een groot aantal gezonde Myoblast cellen die krachtig differentiëren in spontaan trekkingen myotubes. Het heeft ons in staat om metabolisme en circadiane ritmes te bestuderen in primaire myotubes van muizen van een verscheidenheid van genotypes. Tot slot, we omvatten methoden voor de voorbereiding van myotubes voor de studie van oxidatieve metabolisme, met behulp van metingen van de zuurstofverbruik in 96-goed platen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Skeletspieren is van vitaal belang voor de oprichting en het onderhoud van metabole homeostase11. De studie van spier fysiologie is gecompliceerd door interindividuele variabiliteit, evenals moeilijkheden bij het verkrijgen van monsters, met name in het geval van menselijke studies. Gekweekte primaire myotubes is aangetoond dat het even vele kenmerken van spier fysiologie, met inbegrip van calcium homeostase12, regeneratie van beschadigde spierweefsel5</su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs zijn dankbaar voor Dr. Matthew watt aan de Universiteit van Melbourne en Dr. Anastasia Kralli aan de Johns Hopkins University voor hulp bij de aanneming van dit protocol op basis van het werk van Mokbel et al.6. We danken Dr. Sabine Jordan ook voor hulp bij het ontwikkelen en aannemen van dit protocol in ons laboratorium. Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health R01s DK097164 en DK112927 tot K.A.L.
Materials
| Coating Solution: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Collagen | Life Technologies | A1064401 | 1.7 mL |
| Matrigel | Fisher | CB40234A | 1 mL |
| Plating Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 12.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 20 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Myoblast Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 17.5 mL |
| Heat Inactivated FBS | Life Technologies | 16000044 | 10 mL; can be purchased as regular FBS and heat-inactivated by placing in a 40 °C water bath for 20 minutes |
| Amniomax | Life Technologies | 12556023 | 5 mL |
| Differentiation Media: | |||
| DMEM | Gibco | 10569010 | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| HAMS F12 | Lonza | 12-615F | Always add gentamicin (1:1000 by volume) prior to use; 24 mL |
| Heat Inactivated Horse Serum | Sigma | H1138 | 1.5 mL |
| Insulin-Selenium-Transferrin | Life Technologies | 41400045 | 0.5 mL |
| Other Materials: | |||
| PBS | Gibco | 14040133 | |
| Gentamicin | Sigma | G1397 | |
| TrypLE | Gibco | 12604013 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | Prepare as 10% DMSO in Myoblast Media for freezing cells |
| Forceps | Any | ||
| Razor Blades | Any | ||
| Scissors | Any | ||
| Whatman paper | VWR | 21427-648 | |
| 60 mm plate | VWR | 734-2318 | |
| 10 cm plate | VWR | 25382-428 (CS) | |
| T25 Flasks | ThermoFisher | 156367 | |
| T75 Flasks | ThermoFisher | 156499 | |
| Centrifuge Tubes (15mL) | BioPioneer | CNT-15 | |
| Oxygen Consumption Rates: | |||
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent | Seahorse XFe96 Analyzer | Instrument used to measure oxygen consumption rates read out by acidification of the extracellular media |
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent | 102416-100 | 96-well plates for use in XFe96 Analyzer |
| Seahorse XF Cell Mito Stress Test Kit | Agilent | 103015-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Seahorse XF Palmitate-BSA FAO substrate | Agilent | 102720-100 | components may be purchased from other suppliers once assay is established; some recommendations are listed below |
| Palmitic acid | Sigma | P5585-10G | for measurement of fatty acid oxidation |
| carnitine | Sigma | C0283-5G | for measurement of fatty acid oxidation |
| Etomoxir | Sigma | E1905 | for measurement of fatty acid oxidation |
| BSA | Sigma | A7030 | used as control or in conjugation with palmitic acid for use in measurement of fatty acid oxidation |
References
- Srikanthan, P., Karlamangla, A. S. Muscle mass index as a predictor of longevity in older adults. American Journal of Medicine. 127 (6), 547-553 (2014).
- Lee-Young, R. S., Kang, L., Ayala, J. E., Wasserman, D. H., Fueger, P. T. The physiological regulation of glucose flux into muscle in vivo. Journal of Experimental Biology. 214 (2), 254-262 (2010).
- Sjøberg, K. A., et al. Exercise increases human skeletal muscle insulin sensitivity via coordinated increases in microvascular perfusion and molecular signaling. Diabetes. 66 (6), 1501-1510 (2017).
- Girgis, C. M., Clifton-Bligh, R. J., Mokbel, N., Cheng, K., Gunton, J. E. Vitamin D signaling regulates proliferation, differentiation, and myotube size in C2C12 skeletal muscle cells. Endocrinology. 155 (2), 347-357 (2014).
- Smith, J., Merrick, D. Embryonic skeletal muscle microexplant culture and isolation of skeletal muscle stem cells. Methods in Molecular Biology. 633, 29-56 (2010).
- Mokbel, N., et al. K7del is a common TPM2 gene mutation associated with nemaline myopathy and raised myofibre calcium sensitivity. Brain. 136 (2), 494-507 (2013).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
- Rando, T. A., Blau, H. M. Primary mouse myoblast purification, characterization, and transplantation for cell-mediated gene therapy. Journal of Cell Biology. 125 (6), 1275-1287 (1994).
- Musarò, A., Carosio, S. Isolation and Culture of Satellite Cells from Mouse Skeletal Muscle. Methods in Molecular Biology. 1553, 155-167 (2017).
- Smolina, N., Bruton, J., Kostareva, A., Sejersen, T. Assaying mitochondrial respiration as an indicator of cellular metabolism and fitness. Methods in Molecular Biology. 1601, 79-87 (2017).
- Elliott, B., Renshaw, D., Getting, S., Mackenzie, R. The central role of myostatin in skeletal muscle and whole body homeostasis. Acta Physiologica. 205 (3), 324-340 (2012).
- Smolina, N., Kostareva, A., Bruton, J., Karpushev, A., Sjoberg, G., Sejersen, T. Primary murine myotubes as a model for investigating muscular dystrophy. BioMed Research International. , (2015).
- Nedachi, T., Fujita, H., Kanzaki, M. Contractile C 2 C 12 myotube model for studying exercise-inducible responses in skeletal muscle. American Journal of Physiology-Endocrinology and Metabolism. 295 (5), E1191-E1204 (2008).
- Chen, M. B., et al. Impaired activation of AMP-kinase and fatty acid oxidation by globular adiponectin in cultured human skeletal muscle of obese type 2 diabetics. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism. 90 (6), 3665-3672 (2005).
- Douillard-Guilloux, G., Mouly, V., Caillaud, C., Richard, E. Immortalization of murine muscle cells from lysosomal α-glucosidase deficient mice: A new tool to study pathophysiology and assess therapeutic strategies for Pompe disease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 388 (2), 333-338 (2009).
- Varga, B., et al. Myotube elasticity of an amyotrophic lateral sclerosis mouse model. Scientific Reports. 8 (1), 5917 (2018).
- Kriebs, A., et al. Circadian repressors CRY1 and CRY2 broadly interact with nuclear receptors and modulate transcriptional activity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (33), 8776-8781 (2017).
- Cho, Y., et al. Perm1 enhances mitochondrial biogenesis, oxidative capacity, and fatigue resistance in adult skeletal muscle. FASEB Journal. 30 (2), 674-687 (2016).
